网络药理学和分子对接预测靶点
预测细辛活性成分治疗肥胖的潜在分子靶点和信号通路。
利用TCMSP数据库获取细辛活性成分,筛选OB≥30%和DL≥0.18,获取肥胖相关靶点,构建PPI网络并进行GO和KEGG富集分析,然后对核心靶点与主要成分进行分子对接。
Ameliorative effects of Asiasarum root and rhizome extract on high fat diet‑induced obesity in mice through regulation of the SIRT1/PGC1α/AMPK pathways in muscle and liver tissues.
实验包含体外C2C12肌管模型、体内HFD诱导肥胖小鼠模型,以及网络药理学和分子对接分析,进行了功能验证和机制验证,证据层级独立。
C2C12小鼠骨骼肌细胞系 高脂饮食诱导的C57BL/6肥胖小鼠模型 293细胞系(用于肾毒性评估)
C2C12肌管分化条件和Asarum提取物处理剂量(0.25、0.5、1 mg/ml)与时间(24 h) HFD诱导肥胖小鼠分组、给药剂量(500 mg/kg Asarum提取物,250 mg/kg二甲双胍)与给药方式(口服灌胃,每日一次,持续4周) 用于Western blot分析的蛋白表达检测,包括SIRT1、PGC1α、NRF1、p-AMPK、GLUT4等 OGTT中葡萄糖剂量(2 g/kg体重)和测量时间点(15、30、60、120 min)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预测细辛活性成分治疗肥胖的潜在分子靶点和信号通路。
利用TCMSP数据库获取细辛活性成分,筛选OB≥30%和DL≥0.18,获取肥胖相关靶点,构建PPI网络并进行GO和KEGG富集分析,然后对核心靶点与主要成分进行分子对接。
评估细辛提取物对C2C12肌管分化及能量代谢相关蛋白表达的影响。
C2C12成肌细胞分化成肌管后,用不同浓度细辛提取物或二甲双胍处理24小时,Western blot分析蛋白表达,免疫细胞化学检测MyHC阳性肌管长度。
建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型,并观察细辛提取物的抗肥胖效果。
C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组和高脂饮食组,高脂饮食8周后分为对照组、Asarum组和二甲双胍组,口服给药4周,监测体重、空腹血糖、食物摄入,并进行OGTT。
评估细辛提取物对肥胖小鼠血清生化指标和组织病理变化的影响。
检测血清中血糖、胰岛素、血脂水平(TG、TC、LDL-C、HDL-C)及毒性指标(AST、ALT、BUN、CRE),并对肝脏、胰腺、脂肪和肌肉组织进行H&E染色观察。
验证细辛提取物对肥胖小鼠腓肠肌和肝脏组织中SIRT1/PGC1α/AMPK通路相关蛋白表达的影响。
收集腓肠肌和肝脏组织,Western blot检测SIRT1、PGC1α、NRF1、p-AMPK、GLUT4、MyHC、MyoD、myogenin等蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Corning, Inc. | -- |
| 青霉素/链霉素 | Corning, Inc. | -- | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 16000044 | |
| 马血清 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 16050122 | |
| Western blot | 组织蛋白裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78510 |
| 放射免疫沉淀分析裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 89901 | |
| 蛋白测定缓冲液 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 5000006 | |
| 抗NRF1抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 69432 | |
| 抗磷酸化AMPK抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 2537 | |
| 抗AMPK抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 2532 | |
| 抗GLUT4抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7938 | |
| 抗MyoD抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-377460 | |
| 抗肌细胞生成素抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-52903 | |
| 抗肌球蛋白重链抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376157 | |
| 抗SIRT1抗体 | BIOSS | bs-0921R | |
| 抗PGC1α抗体 | Novus Biologicals, LLC (Bio-Techne) | NBP1-04676 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体 | MilliporeSigma | BR1706515 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体 | MilliporeSigma | BR1706516 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | MilliporeSigma | A1978 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abfrontier | LF-PA0018 | |
| EveryBlot封闭缓冲液 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 12010020 | |
| HPLC分析 | 细辛脂素 | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. | MUST-22050912 |
| 芝麻素 | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. | MUST-21110513 | |
| 血清分析 | 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 |
| 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 | |
| 血尿素氮检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C013-2-1 | |
| 肌酐检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C011-2-1 | |
| 细胞培养 | C2C12成肌细胞 | American Type Culture Collection | CRL-1772 |
| 293细胞 | Korean Cell Line Bank | 84129 | |
| 血清分析 | 胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒 | Crystal Chem, Inc. | 90080 |
| HPLC分析 | 安捷伦1260 Infinity II高效液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| 细胞培养 | 莱卡荧光显微镜 | Leica Microsystems GmbH | -- |
| Western blot | ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- |
| 数据分析 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
| Prism 6软件 | GraphPad Software, Inc; Dotmatics | -- | |
| 分子对接 | PyMOL软件 | -- | -- |
| AutoDock软件 | -- | -- | |
| AutoDock Vina软件 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞实验 | C2C12细胞分化条件(2%马血清,4天),Asarum提取物处理浓度(0.25、0.5、1 mg/ml)和处理时间(24小时) 阅读提示:Materials and methods, Cell culture and treatment; Figure legends 3 and 4 |
| 动物模型建立与给药 | C57BL/6小鼠周龄、性别(6周龄雄性)、饮食诱导时间(HFD 8周后分组)、给药剂量(Asarum 500 mg/kg、MET 250 mg/kg)和频率(每日一次,口服灌胃,4周) 阅读提示:Materials and methods, Preparation of an animal model of obesity; Table I |
| 血清生化检测 | 血糖、胰岛素、TG、TC、LDL-C、HDL-C检测方法,AST、ALT、BUN、CRE试剂盒使用 阅读提示:Materials and methods, Serological analysis |
| Western blot | 组织/细胞蛋白提取方法(RIPA裂解缓冲液)、上样量(30 µg/泳道)、抗体稀释比例(如SIRT1 1:1000, PGC1α 1:1000) 阅读提示:Materials and methods, Western blot analysis |
| HPLC分析 | HPLC系统、标准品(细辛脂素和芝麻素)、色谱条件(详见附录I) 阅读提示:Materials and methods, HPLC analysis; Figure 11 |