硬膜外脂肪来源间充质干细胞的永生化:体外特征与脂肪细胞分化潜力

Immortalization of epidural fat-derived mesenchymal stem cells: In vitro characterization and adipocyte differentiation potential.

作者信息Seoung-Woo Lee, Young-Ju Lim, Hee-Yeon Kim, Wansoo Kim, Wook-Tae Park, Min-Jung Ma, Junho Lee, Min-Soo Seo, Young In Kim, Sangbum Park, Seong-Kyoon Choi, Gun Woo Lee
PMID39866894
发布时间2025-01-26
DOI10.4252/wjsc.v17.i1.98777

实验完整度

包含细胞分离、永生化、功能验证(成脂分化)、表型鉴定(FACS)、衰老检测及蛋白质组学分析等多个独立证据层级,具有明确的功能和机制验证。

主要模型

硬膜外脂肪来源间充质干细胞(EF-MSCs) 永生化EF-MSCs(E6E7、hTERT/E6E7) hTERT重转染EF-MSCs(hTERT-Re)

重点核对

EF-MSCs分离自人硬膜外脂肪,经胶原酶消化和SVF分离 慢病毒转导永生化,使用hTERT和E6/E7基因 成脂分化使用StemPro Adipogenesis Differentiation Kit,处理1周 细胞衰老检测使用β-半乳糖苷酶染色 蛋白质组学分析比较母亲细胞、E6E7、hTERT/E6E7和hTERT-Re细胞

摘要

背景:间充质干细胞(MSCs)因其自我更新能力、多向分化潜力和免疫调节作用,是再生治疗的有前景的候选者。MSCs的分子特征受其位置影响。近来,硬膜外脂肪(EF)和EF来源的MSCs(EF-MSCs)因其对脊髓微环境的潜在益处以及神经干细胞标志物的高表达而受到关注。然而,由于细胞衰老和EF的可及性有限,其临床应用受到限制。尽管许多研究试图建立永生化的、稳定的干细胞系,但永生化EF-MSCs的特征仍有待阐明。目的:建立并分析稳定的永生化EF-MSCs。方法:使用光学显微镜分析EF-MSCs的表型。使用慢病毒载体进行细胞永生化。通过免疫印迹、定量PCR和蛋白质组学分析细胞的生物分子特征。结果:与对照组相比,永生化EF-MSCs的寿命显著延长,且保持良好的成脂潜力和干细胞表面标志物表达。人端粒酶逆转录酶基因的引入显著增加了EF-MSCs的寿命。蛋白质组学分析显示,永生化EF-MSCs中DNA复制通路组分的表达显著增加。结论:永生化EF-MSCs表现出显著增强的增殖能力,保留了成脂潜力,并上调了DNA复制通路组分的表达。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
建立稳定的永生化硬膜外脂肪来源间充质干细胞系,并分析其体外特征和成脂分化潜力。
核心机制
永生化EF-MSCs通过上调DNA复制通路组分的表达,延长细胞寿命并保留干细胞特性。
主要证据
永生化EF-MSCs(E6E7和hTERT/E6E7)寿命显著延长(超过30代),且保留干细胞表面标志物和成脂分化能力;hTERT重转染后细胞增殖超过100代,β-半乳糖苷酶染色阳性面积显著减少;蛋白质组学分析显示DNA复制通路组分显著上调。
研究意义
该研究为EF-MSCs的再生医学研究和临床应用提供了有价值的参考,有助于克服EF-MSCs分离困难和增殖受限的障碍。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

EF-MSCs的分离与鉴定

从人硬膜外脂肪中分离MSCs,并验证其干细胞特性。

使用胶原酶消化和SVF分离获得EF-MSCs,通过光学显微镜观察形态,FACS分析表面标志物,成脂分化实验和油红O染色评估成脂潜力,免疫印迹检测C/EBPα表达。

2

慢病毒介导的永生化

通过转导hTERT和E6/E7基因,延长EF-MSCs的寿命。

使用慢病毒载体转导第5代EF-MSCs,转染后自然选择永生细胞,通过qPCR确认基因表达,观察细胞形态和增殖能力。

3

永生化EF-MSCs的特性维持评估

验证永生化后细胞是否保留干细胞特性和成脂分化潜力。

通过FACS分析表面标志物,成脂分化实验和油红O染色评估成脂潜力,免疫印迹检测C/EBPα表达,β-半乳糖苷酶染色评估衰老。

4

hTERT重转染恢复增殖能力

恢复永生化EF-MSCs在传代后期出现的生长停滞。

对第30代hTERT/E6E7 EF-MSCs进行hTERT重转染,观察细胞增殖能力、表面标志物表达和成脂分化潜力。

5

蛋白质组学分析

比较永生化前后细胞蛋白表达谱的差异。

对母亲、E6E7、hTERT/E6E7和hTERT-Re细胞进行蛋白质组学分析,包括热图、KEGG通路富集分析、主成分分析和维恩图。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
胶原酶Gibco17018-029
杜尔贝科改良伊格尔培养基Gibco17018-029
胎牛血清Gibco26140-079
青霉素-链霉素Gibco15150-122
细胞过滤器SPL Life Sciences93070
磷酸盐缓冲液CytivaSH30256.01
胰蛋白酶-EDTAGibco25300-062
编码hTERT和E6/E7的慢病毒载体Applied Biological Materials, Inc.--
聚凝胺----
细胞RNA提取试剂盒Takara Bio Inc.9767A
NanoDrop One分光光度计Thermo Fisher Scientific--
cDNA合成试剂盒Takara6110A
TB Green预混液TakaraRR071A
CFX96实时荧光定量PCR系统Bio-Rad--
BD Accuri C6流式细胞仪BD Biosciences--
抗CD105抗体NovusNB110-58718
抗CD90抗体Thermo Fisher Scientific14-0909-82
抗CD73抗体NovusNBP2-48480
抗CD45抗体GeneTexGTX116018
抗CD34抗体Proteintech60180-1-Ig
抗HLA-DR抗体Bioss Antibodiesbsm-52535R
Alexa Fluor 488-驴抗鼠IgGAbcamab150105
Alexa Fluor 555-驴抗兔IgGAbcamab150066
StemPro成脂分化试剂盒GibcoA1007001
油红O试剂盒LifelineLL-0052
Leica DM 5000光学显微镜Leica--
ImageJ软件----
Laemmli SDS上样缓冲液GenDepotL1100-001
半干转印系统Bio-Rad--
EveryBlot封闭缓冲液Bio-Rad12010020
抗β-肌动蛋白抗体Thermo Fisher ScientificMA5-15739
抗C/EBPα抗体Cell Signaling Technology2295
Clarity Western增强化学发光底物Bio-Rad1705061
ChemiDoc MP成像系统Bio-Rad--
β-半乳糖苷酶染色试剂盒Cell Signaling Technology9860

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
EF-MSCs分离
人硬膜外脂肪组织来源;胶原酶消化浓度和时间(2 mg/mL,37°C,30分钟);细胞培养条件(DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素)
阅读提示:Materials and Methods: EF-MSC isolation
永生化
第5代EF-MSCs;慢病毒载体(hTERT和E6/E7)与新鲜培养基1:1混合,添加8 μg/mL polybrene;转染后孵育过夜,3天后换液
阅读提示:Materials and Methods: Immortalization
FACS分析
细胞汇合度60%-70%;一抗稀释度1:200,二抗1:500;流式细胞仪型号
阅读提示:Materials and Methods: Fluorescence-activated single cell sorting; Table 1
成脂分化
细胞接种密度(50%-60%汇合);分化培养基处理1周;油红O染色定量使用5个随机视野
阅读提示:Materials and Methods: Adipogenic differentiation assay
蛋白质组学
比较的母亲、E6E7、hTERT/E6E7和hTERT-Re细胞;蛋白质组学分析的具体方法在文中未明确说明
阅读提示:Materials and Methods: Proteomics analysis(未在原文Methods中详述,仅在Results中提及)