EF-MSCs的分离与鉴定
从人硬膜外脂肪中分离MSCs,并验证其干细胞特性。
使用胶原酶消化和SVF分离获得EF-MSCs,通过光学显微镜观察形态,FACS分析表面标志物,成脂分化实验和油红O染色评估成脂潜力,免疫印迹检测C/EBPα表达。
Immortalization of epidural fat-derived mesenchymal stem cells: In vitro characterization and adipocyte differentiation potential.
包含细胞分离、永生化、功能验证(成脂分化)、表型鉴定(FACS)、衰老检测及蛋白质组学分析等多个独立证据层级,具有明确的功能和机制验证。
硬膜外脂肪来源间充质干细胞(EF-MSCs) 永生化EF-MSCs(E6E7、hTERT/E6E7) hTERT重转染EF-MSCs(hTERT-Re)
EF-MSCs分离自人硬膜外脂肪,经胶原酶消化和SVF分离 慢病毒转导永生化,使用hTERT和E6/E7基因 成脂分化使用StemPro Adipogenesis Differentiation Kit,处理1周 细胞衰老检测使用β-半乳糖苷酶染色 蛋白质组学分析比较母亲细胞、E6E7、hTERT/E6E7和hTERT-Re细胞
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从人硬膜外脂肪中分离MSCs,并验证其干细胞特性。
使用胶原酶消化和SVF分离获得EF-MSCs,通过光学显微镜观察形态,FACS分析表面标志物,成脂分化实验和油红O染色评估成脂潜力,免疫印迹检测C/EBPα表达。
通过转导hTERT和E6/E7基因,延长EF-MSCs的寿命。
使用慢病毒载体转导第5代EF-MSCs,转染后自然选择永生细胞,通过qPCR确认基因表达,观察细胞形态和增殖能力。
验证永生化后细胞是否保留干细胞特性和成脂分化潜力。
通过FACS分析表面标志物,成脂分化实验和油红O染色评估成脂潜力,免疫印迹检测C/EBPα表达,β-半乳糖苷酶染色评估衰老。
恢复永生化EF-MSCs在传代后期出现的生长停滞。
对第30代hTERT/E6E7 EF-MSCs进行hTERT重转染,观察细胞增殖能力、表面标志物表达和成脂分化潜力。
比较永生化前后细胞蛋白表达谱的差异。
对母亲、E6E7、hTERT/E6E7和hTERT-Re细胞进行蛋白质组学分析,包括热图、KEGG通路富集分析、主成分分析和维恩图。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | 胶原酶 | Gibco | 17018-029 |
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | 17018-029 |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140-079 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15150-122 | |
| 细胞分离 | 细胞过滤器 | SPL Life Sciences | 93070 |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Cytiva | SH30256.01 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-062 | |
| 永生化 | 编码hTERT和E6/E7的慢病毒载体 | Applied Biological Materials, Inc. | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| qPCR | 细胞RNA提取试剂盒 | Takara Bio Inc. | 9767A |
| NanoDrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| cDNA合成试剂盒 | Takara | 6110A | |
| TB Green预混液 | Takara | RR071A | |
| CFX96实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| 流式分析 | BD Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FACS抗体 | 抗CD105抗体 | Novus | NB110-58718 |
| 抗CD90抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0909-82 | |
| 抗CD73抗体 | Novus | NBP2-48480 | |
| 抗CD45抗体 | GeneTex | GTX116018 | |
| 抗CD34抗体 | Proteintech | 60180-1-Ig | |
| 抗HLA-DR抗体 | Bioss Antibodies | bsm-52535R | |
| Alexa Fluor 488-驴抗鼠IgG | Abcam | ab150105 | |
| Alexa Fluor 555-驴抗兔IgG | Abcam | ab150066 | |
| 成脂分化 | StemPro成脂分化试剂盒 | Gibco | A1007001 |
| 油红O试剂盒 | Lifeline | LL-0052 | |
| 成像 | Leica DM 5000光学显微镜 | Leica | -- |
| 成像定量分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 免疫印迹 | Laemmli SDS上样缓冲液 | GenDepot | L1100-001 |
| 半干转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| EveryBlot封闭缓冲液 | Bio-Rad | 12010020 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-15739 | |
| 抗C/EBPα抗体 | Cell Signaling Technology | 2295 | |
| Clarity Western增强化学发光底物 | Bio-Rad | 1705061 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 衰老检测 | β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9860 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EF-MSCs分离 | 人硬膜外脂肪组织来源;胶原酶消化浓度和时间(2 mg/mL,37°C,30分钟);细胞培养条件(DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素) 阅读提示:Materials and Methods: EF-MSC isolation |
| 永生化 | 第5代EF-MSCs;慢病毒载体(hTERT和E6/E7)与新鲜培养基1:1混合,添加8 μg/mL polybrene;转染后孵育过夜,3天后换液 阅读提示:Materials and Methods: Immortalization |
| FACS分析 | 细胞汇合度60%-70%;一抗稀释度1:200,二抗1:500;流式细胞仪型号 阅读提示:Materials and Methods: Fluorescence-activated single cell sorting; Table 1 |
| 成脂分化 | 细胞接种密度(50%-60%汇合);分化培养基处理1周;油红O染色定量使用5个随机视野 阅读提示:Materials and Methods: Adipogenic differentiation assay |
| 蛋白质组学 | 比较的母亲、E6E7、hTERT/E6E7和hTERT-Re细胞;蛋白质组学分析的具体方法在文中未明确说明 阅读提示:Materials and Methods: Proteomics analysis(未在原文Methods中详述,仅在Results中提及) |