加热不燃烧技术影响大鼠血浆睾酮水平及睾丸炎症、氧化应激标志物

Heat-not-burn technology affects plasma testosterone levels and markers of inflammation, oxidative stress in the testes of rats.

作者信息Silvia Granata, Camilla Morosini, Maria Chiara Valerii, Ivan Fagiolino, Stefano Sangiorgi, Severino Ghini, Enzo Spisni, Fabio Vivarelli, Lucy C Fairclough, Moreno Paolini, Donatella Canistro
PMID39902465
发布时间2025-01-06
DOI10.3389/ftox.2024.1515850

实验完整度

中

本研究采用动物体内模型,检测了氧化应激、DNA损伤、炎症、类固醇生成等分子和生化指标,但缺乏组织学、精子计数等功能验证。

主要模型

Sprague-Dawley大鼠(7周龄,雄性) 全身暴露模型

重点核对

暴露方式:全身暴露 暴露频率:每周5天,持续4周 每日暴露时长:最多3小时,消耗8支烟草棒 动物数量:对照组n=6,暴露组n=6 免疫印迹样本数:对照组n=4,暴露组n=5

摘要

引言:加热烟草产品(HTPs)是先进的电子烟型号,被FDA归类为改良风险烟草产品,可作为戒烟努力的一部分。利用加热不燃烧(HnB)技术,这些设备加热烟草以避免完全燃烧。尽管主流烟雾中有毒物水平显著低于烟草烟雾,但近期一些研究对其使用相关的潜在健康风险提出了担忧,特别是对男性性腺功能的影响,这些影响在很大程度上仍未探索。方法:成年雄性Sprague-Dawley大鼠全身暴露于HnB主流烟雾,每周5天,持续4周。结果:细胞周期调控因子Bax/Bcl-2比值和p38的表达未受影响。另一方面,在暴露动物中观察到氧化应激标志物(包括与DNA损伤相关的标志物)增加,以及NF-kB依赖性促炎介质(TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2)的诱导。此外,关键雄激素酶如3β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶的失活,以及睾酮合成减少,提示男性性腺功能可能受损。讨论:结果表明,暴露于HnB烟雾的动物显示出更高水平的氧化应激标志物,包括与DNA损伤相关的标志物,以及更高水平的促炎细胞因子。一些雄激素关键酶和与生精上皮活性相关的酶的损伤,加上睾酮水平的降低,提示通过改变一些通常与烟草消费相关的细胞通路导致性腺功能受损。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
HnB烟草烟雾暴露对大鼠睾丸功能的影响及其潜在机制
核心机制
HnB烟雾暴露诱导氧化应激和DNA损伤,激活NF-κB介导的炎症反应,抑制类固醇生成酶(3β-HSD和17β-HSD)活性,导致睾酮合成减少,影响睾丸功能。
主要证据
与对照组相比,暴露组大鼠睾丸ROS、MDA、蛋白羰基和8-OHdG水平显著升高;DNA修复酶OGG-1、γ-H2AX和PARP-1上调;NF-κB磷酸化及TNF-α、IL-1β、IL-6表达增加;3β-HSD和17β-HSD活性降低,血浆睾酮水平下降。
研究意义
尽管HnB烟雾中有毒物浓度低于传统卷烟,但仍可诱导类似烟草消费相关的毒性效应,可能对男性性腺功能构成风险,提示在推广HnB作为戒烟工具时应谨慎。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

化学表征

分析HnB主流烟雾中的化学成分,以确定暴露水平。

使用GC-MS分析HnB主流烟雾中的醛类、PAHs、VOCs和尼古丁浓度。

2

动物暴露

建立大鼠HnB烟雾暴露模型。

成年雄性Sprague-Dawley大鼠全身暴露于HnB烟雾,每周5天,持续4周。

3

氧化应激标志物检测

评估HnB烟雾暴露对大鼠睾丸氧化应激水平的影响。

检测ROS含量(DCFH-DA法)、MDA水平、蛋白羰基含量和8-OHdG水平。

4

DNA损伤和修复机制检测

探究HnB烟雾暴露引起的DNA氧化损伤及修复机制的激活。

通过Western blot检测OGG-1、γ-H2AX、PARP-1和XPC的表达水平。

5

抗氧化酶活性检测

评估HnB烟雾暴露对抗氧化酶活性的影响。

测定CAT、NQO1、SOD、GSSG-Red、GSH-Px和XO的酶活性。

6

炎症标志物检测

评估HnB烟雾暴露对睾丸炎症反应的影响。

通过Western blot检测NF-κB磷酸化、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和COX-2的表达。

7

类固醇生成酶活性及睾酮水平检测

评估HnB烟雾暴露对睾酮合成的影响。

测定3β-HSD和17β-HSD活性,并通过ELISA检测血浆睾酮水平。

8

细胞周期和信号通路检测

探究HnB烟雾暴露对细胞周期和MAPK信号通路的影响。

通过Western blot检测Bax/Bcl-2比值、p38、ERK1/2磷酸化和c-MYC表达。

9

CYP酶活性检测

评估HnB烟雾暴露对睾丸CYP酶活性的影响。

测定CYP1A1、CYP2B1/2和CYP2A1/2的活性。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
THS 2.2PMI--
HEETS青铜PMI--
Hamilton气密注射器Hamilton--
气相色谱-质谱联用(QP-2010 Plus)ShimadzuQP-2010
RTX-WAX色谱柱Restek--
Zoletil 100----
T-PER组织蛋白提取试剂Thermo Scientific--
Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物Thermo Scientific--
Pierce BCA蛋白检测试剂盒Invitrogen Thermo Scientific--
2',7'-二氯荧光素二乙酸酯--4091-99-0
DNA/RNA氧化损伤ELISA试剂盒Cayman Chemicals--
AllPrep DNA/RNA试剂盒QIAGEN--
DNA降解酶Plus试剂盒Zymo Research--
睾酮ELISA试剂盒Antibodies--
Bolt 4%-12% Bis-tris Plus凝胶Invitrogen Thermo Scientific--
SeeBlue Plus-2蛋白质标准Life Technologies, Thermo Scientific--
硝酸纤维素膜Novex-Life Technologies, Thermo Scientific--
Pierce Clear Milk封闭缓冲液Thermo Scientific--
Clarity Western ECL底物Bio-Rad--
Chemidoc MP成像系统Bio-Rad Laboratories--
ImageJ 1.7.0----
α-微管蛋白抗体Thermo Scientific14-4502-82
NRF2抗体ABClonalA0674
IL-6抗体ABClonalA0286
IL-8抗体ABClonalA02541
NF-κB(磷酸化Ser 536)抗体ABClonalAP1294
NF-κB抗体ABClonalA2547
TNF-α抗体ABClonalA2547
IL-1β抗体ABClonalA17376
COX-2抗体BiossBS0732
H2AX(磷酸化Ser 139)抗体ABClonalAP009
H2AX抗体ABClonalA11361
OGG-1抗体ElabscienceE-AB-60300
XPC抗体Cloud-Clone CorpPAA473rA01
CYP 1A1抗体Cloud-Clone CorpPAD29Ra01
SIRT-1抗体ABclonalA11267
SOD-1抗体Choesion BioscienceCPA9446
CAT抗体Cloud-Clone CorpPAC418Ra01
Perkin Elmer LS 50 B荧光分光光度计Perkin ElmerLS
TEACAN GENios酶标仪Tecan--
牛血清白蛋白--9048-46-8

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物暴露
暴露方式:全身暴露;烟雾浓度:尼古丁浓度低于LC50(2.3 mg/L);每日暴露时长:最多3小时;烟草棒数量:8支/腔室;暴露频率:5天/周,持续4周;动物数:对照组n=6,暴露组n=6;动物品系:Sprague-Dawley大鼠(7周龄)。
阅读提示:Methods: 2.3 Animal exposure
氧化应激标志物检测
ROS检测:DCFH-DA浓度100 μM,孵育37°C 30min;MDA检测:TBA浓度40 mM,沸水浴60min;蛋白羰基检测:DNPH浓度10 mM,室温1h;8-OHdG检测:使用Cayman试剂盒,操作按说明书。
阅读提示:Methods: 2.6, 2.7, 2.8, 2.9
Western blot
蛋白提取:T-PER试剂;上样量:20 μg;一抗稀释度:1:500或1:1000;内参:α-tubulin;二抗:HRP标记;检测:化学发光。
阅读提示:Methods: 2.20
睾酮检测
血浆样本采集:尾静脉,2分钟内;储存:EDTA管,4°C,30分钟内离心;检测方法:竞争ELISA试剂盒。
阅读提示:Methods: 2.19