人源唾液腺及口腔相关细胞中ACE2和TMPRSS2表达模式分析
比较人唾液腺、口腔黏膜上皮细胞和细胞系中ACE2和TMPRSS2蛋白表达差异。
收集人唾液腺（hSG）提取物、A253、HSC-2、HGK、HOK细胞裂解液，通过Western blot检测ACE2和TMPRSS2蛋白表达。
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二甲双胍与衰老对唾液腺中ACE2和TMPRSS2表达的影响
Involvement of metformin and aging in salivary expression of ACE2 and TMPRSS2.
实验完整度
高包含体外细胞实验（A253、HSC-2、HGK、HOK及原代MSEC）、体内小鼠模型（年轻与老年小鼠、二甲双胍处理）及组织/唾液的蛋白和mRNA表达分析，并进行了功能验证（唾液分泌量）和机制相关检测（ADAM17、SA-β-gal）。
主要模型
年轻和老年C57BL/6N雄性小鼠 小鼠唾液腺原代上皮细胞（MSEC） A-253人下颌下腺癌细胞系 人原代牙龈角质形成细胞（HGK）和口腔角质形成细胞（HOK）
重点核对
二甲双胍给药方式：通过饮水口服，剂量5 mg/mL，从6周龄开始连续给药8至10周 小鼠品系、性别和年龄：C57BL/6N雄性，年轻6周龄，老年18-22个月 唾液刺激与收集：使用毛果芸香碱刺激后收集，并测量体积 Western blot检测蛋白：ACE2（AF3437用于组织、AF933用于唾液）、TMPRSS2（sc-515727用于人、bs-6285R用于鼠）、ADAM17（GTX101358）等 统计分析：未配对Student's t-test或Dunnett's多重比较检验，p<0.05为显著
摘要
SARS-CoV-2相关蛋白ACE2和TMPRSS2是SARS-CoV-2感染的决定因素。尽管这些蛋白在口腔相关组织中表达，但它们在唾液腺中的表达模式和调节机制尚不清楚。我们在此表明，全长ACE2（具有完全功能的酶催化位点和SARS-CoV-2刺突S1蛋白高亲和力结合位点）在唾液腺中的表达高于口腔黏膜上皮细胞和肺。对于TMPRSS2，酶原和切割形式均在唾液腺中表达，而小鼠泪腺和肺中仅表达酶原。二甲双胍（一种AMPK激活剂）增加了刺激后的唾液分泌和唾液腺中全长ACE2的表达，并降低了切割形式TMPRSS2的表达，且对唾液中的可溶性ACE2（sACE2）和可溶性TMPRSS2（sTMPRSS2）产生相同效应。此外，二甲双胍降低了唾液腺中β-半乳糖苷酶（一种衰老标志物）和ADAM17（将ACE2剪切为sACE2的脱落酶）的表达。在老年小鼠中，唾液腺中ACE2的表达降低，而唾液中sACE2的表达增加，可能是由于ADAM17表达上调所致。唾液腺中TMPRSS2和唾液中sTMPRSS2的表达均增加。总的来说，这些结果表明，唾液腺中ACE2和TMPRSS2的蛋白表达模式不同于其他口腔相关细胞和组织，且二甲双胍和衰老影响唾液腺中ACE2和TMPRSS2的表达，这些蛋白具有作为预防SARS-CoV-2传播靶点的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 二甲双胍和衰老是否调节唾液腺和唾液中ACE2与TMPRSS2的表达？
- 核心机制
- 二甲双胍通过AMPK激活可能增强ACE2稳定性，并下调ADAM17从而减少sACE2生成；衰老通过上调ADAM17导致sACE2增加，并上调TMPRSS2表达。
- 主要证据
- Western blot显示唾液腺中fACE2表达高于肺，二甲双胍处理后fACE2上调、cleaved TMPRSS2下调；老年小鼠唾液腺fACE2降低、唾液sACE2和sTMPRSS2升高；免疫组化显示二甲双胍降低SA-β-gal和ADAM17表达。
- 研究意义
- 这些发现为二甲双胍和衰老影响COVID-19严重程度和死亡率的机制提供了见解，并促进唾液腺和唾液作为预防SARS-CoV-2感染和传播的潜在靶点的进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠唾液腺、泪腺和肺中ACE2和TMPRSS2表达分析
评估唾液腺与泪腺、肺中ACE2和TMPRSS2蛋白表达差异。
取年轻小鼠唾液腺、泪腺和肺组织，提取蛋白，Western blot检测ACE2和TMPRSS2。
二甲双胍处理小鼠及唾液腺ACE2和TMPRSS2表达变化
验证二甲双胍对唾液腺和肺中ACE2和TMPRSS2蛋白表达的影响。
年轻小鼠通过饮水给予二甲双胍（5 mg/mL）8-10周，收集唾液腺和肺组织进行Western blot，并检测唾液中sACE2和sTMPRSS2水平。
二甲双胍对唾液腺衰老标志物和ADAM17表达的影响
检测二甲双胍是否改变唾液腺中SA-β-gal和ADAM17的表达。
通过免疫组化检测二甲双胍处理小鼠唾液腺中β-半乳糖苷酶和ADAM17的表达，并在原代MSEC中验证二甲双胍对ADAM17表达的影响。
衰老对唾液腺ACE2、TMPRSS2和ADAM17表达及唾液分泌的影响
探究衰老对唾液腺ACE2、TMPRSS2、ADAM17表达及唾液中sACE2、sTMPRSS2水平的影响。
比较年轻与老年小鼠唾液腺中ACE2、TMPRSS2、ADAM17表达，检测唾液中sACE2、sTMPRSS2和α-淀粉酶水平；利用复制性衰老MSEC检测ADAM17和TMPRSS2表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | C57BL/6N小鼠 | -- | -- |
| RNA提取 | RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA浓度测定 | Nanodrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | PrimeScript RT预混液 | TaKaRa Bio Inc. | -- |
| qRT-PCR | FastStart Essential DNA Green Master | Roche Applied Science | -- |
| LightCycler 96系统 | Roche Applied Science | -- | |
| 细胞培养 | McCoy's 5A（改良）培养基 | -- | -- |
| KGM-Gold™ BulletKit™ | Lonza Japan | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| T-PER™组织蛋白提取试剂 | -- | -- | |
| Miltenyi gentleMACS Octo组织处理器 | Miltenyi | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Laemmli上样缓冲液 | -- | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Bio-Rad | -- | |
| ACE2抗体 | R&D Systems | AF3437 | |
| ACE2抗体（用于唾液） | R&D Systems | AF933 | |
| α-淀粉酶抗体 | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| ADAM17抗体 | GeneTex | GTX101358 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| TMPRSS2抗体（人） | Santa Cruz Biotechnology | sc-515727 | |
| TMPRSS2抗体（鼠） | Bioss | bs-6285R | |
| 水通道蛋白5抗体 | Alomone Labs | AQP-005 | |
| α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| 细胞角蛋白19抗体 | Sigma-Aldrich | MABT913 | |
| p21 Waf1/Cip1抗体 | Cell Signaling Technology | 64016 | |
| Immunostar化学发光底物 | Wako | -- | |
| Amersham Imager 680成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫组化 | 正常兔IgG | Wako | 148-09551 |
| 正常山羊IgG | R&D Systems | AB-108-C | |
| β-半乳糖苷酶抗体 | ProteinTech | 15518-1-AP | |
| TaKaRa POD偶联抗兔免疫组化试剂（鼠组织） | TaKaRa | MK202 | |
| ImmPRESS抗山羊Ig试剂 | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| OLYMPUS cellSens成像软件（版本4.1.1） | OLYMPUS | -- | |
| ELISA | 小鼠ACE-2 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY3437-05 |
| TMB底物试剂 | BD | 555214 | |
| 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | 51119050 | |
| 细胞分离 | 多组织解离试剂盒1 | Miltenyi Biotech | 130-110-201 |
| 小鼠CD45磁珠 | Miltenyi | 130-052-301 | |
| 小鼠CD326（上皮细胞黏附分子）磁珠 | Miltenyi | 130-105-958 | |
| 原代培养 | Defined角质形成细胞无血清培养基 | Gibco | -- |
| Y-27632 | Fujifilm Wako | -- | |
| I型胶原包被的培养皿 | AGC TECHNO GLASS | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism（版本10.0.1） | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与二甲双胍处理 | 小鼠品系、性别、年龄（年轻6周龄，老年18-22个月）、二甲双胍给药剂量（5 mg/mL饮水）、给药时间（8-10周） 阅读提示：Methods部分2.1节及图1C、图2C图注 |
| 唾液收集与测量 | 毛果芸香碱刺激方案、唾液体积测量方法、离心条件（3000g, 4°C, 5分钟） 阅读提示：Methods部分2.1节及图4C图注 |
| 蛋白表达检测 | 抗体类型（ACE2 AF3437/AF933、TMPRSS2 sc-515727/bs-6285R、ADAM17 GTX101358等）、组织裂解方法（T-PER、蛋白酶抑制剂）、蛋白上样量 阅读提示：Methods部分2.4节及图1、图2、图5图注 |
| 免疫组化 | 抗原修复条件（压力锅、柠檬酸磷酸缓冲液pH6.0）、一抗孵育条件（4°C过夜）、定量方法（阳性面积/视野） 阅读提示：Methods部分2.5节及图3、图5B图注 |
| 细胞衰老模型 | MSEC培养条件（Defined Keratinocyte-SFM、10μM Y-27632）、传代次数（至第15代）、二甲双胍处理浓度和时间（0-2mM, 48h） 阅读提示：Methods部分2.8节、2.7节及图3F、图5C-D图注 |