METTL1在cSCC组织和细胞系中的表达分析
评估METTL1在cSCC肿瘤组织和细胞系中的表达水平及其与肿瘤分期的关系。
通过IHC检测36例cSCC和7例正常皮肤组织中METTL1蛋白水平，通过qRT-PCR检测METTL1 mRNA水平，并在cSCC细胞系（HSC-1、A431）和HaCaT角质形成细胞中检测蛋白和mRNA表达及m7G水平。
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METTL1通过ATF4 mRNA的m7G修饰协调皮肤鳞状细胞癌的进展
METTL1 coordinates cutaneous squamous cell carcinoma progression via the m7G modification of the ATF4 mRNA.
实验完整度
高包含细胞实验（增殖、凋亡、迁移、侵袭）、动物模型（异种移植瘤）、机制验证（MeRIP-qPCR、RNA稳定性、荧光素酶报告基因）及代谢分析。
主要模型
cSCC细胞系HSC-1和A431 人正常表皮角质形成细胞HaCaT BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 cSCC患者组织样本和正常皮肤样本
重点核对
METTL1在cSCC组织和细胞系中上调 METTL1敲低抑制细胞存活、迁移和侵袭 METTL1介导ATF4 mRNA的m7G修饰并增强其稳定性 ATF4过表达逆转METTL1敲低的抗肿瘤效应 METTL1敲低在体内抑制肿瘤生长
摘要
甲基转移酶样蛋白1（METTL1）介导的m7G修饰在多种RNA种类中普遍存在，包括mRNA、tRNA、rRNA和miRNA。近期证据表明，这种修饰与多种癌症的发展相关，使其成为癌症治疗的一个有前景的靶点。然而，m7G修饰在皮肤鳞状细胞癌（cSCC）中的具体作用尚不完全清楚。在本研究中，我们观察到cSCC肿瘤和细胞系中METTL1水平显著升高。抑制METTL1导致cSCC细胞存活、迁移、侵袭和异种移植肿瘤生长减少。机制上，通过RNA测序、m7G甲基化免疫沉淀（MeRIP）-qPCR和mRNA稳定性检测相结合，我们发现METTL1负责ATF4 mRNA的m7G修饰，导致ATF4表达增加。重要的是，我们证明了这种修饰依赖于METTL1的甲基转移酶活性。此外，我们观察到cSCC肿瘤中ATF4表达与METTL1水平呈正相关。有趣的是，在cSCC细胞中恢复ATF4表达不仅促进了糖酵解，而且逆转了METTL1敲低的抗肿瘤效应。总之，我们的结果强调了METTL1和m7G修饰在cSCC肿瘤发生中的关键作用，提示了未来cSCC治疗的一个有前景的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- METTL1介导的m7G修饰在皮肤鳞状细胞癌（cSCC）中的作用及机制是什么？
- 核心机制
- METTL1通过其甲基转移酶活性介导ATF4 mRNA的m7G修饰，增强ATF4 mRNA稳定性，上调ATF4表达，促进糖酵解和肿瘤进展。
- 主要证据
- IHC和qRT-PCR显示METTL1在cSCC组织中高表达；METTL1敲低抑制细胞增殖、迁移、侵袭及异种移植瘤生长；MeRIP-qPCR和RNA稳定性实验证实METTL1修饰ATF4 mRNA；ATF4过表达逆转METTL1敲低效应。
- 研究意义
- 研究表明METTL1和m7G修饰在cSCC肿瘤发生中起关键作用，为cSCC治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
METTL1敲低对cSCC细胞功能的影响
验证METTL1对cSCC细胞存活、凋亡、迁移和侵袭的影响。
使用shRNA敲低METTL1后，通过CCK8、EdU、集落形成、Annexin V/PI、TUNEL检测细胞增殖和凋亡；通过伤口愈合、transwell和Matrigel侵袭实验检测迁移和侵袭。
METTL1敲低对体内肿瘤生长的影响
评估METTL1在体内对cSCC肿瘤生长的作用。
将METTL1敲低的HSC-1和A431细胞皮下注射到裸鼠，监测肿瘤体积和重量，并通过IHC、western blot和qRT-PCR检测PCNA表达。
METTL1介导ATF4 mRNA的m7G修饰及机制验证
探索METTL1调控的下游靶基因及m7G修饰机制。
通过RNA-seq鉴定METTL1敲低后的差异表达基因，结合MeRIP-qPCR、RNA稳定性实验、dot blot、双荧光素酶报告基因实验验证METTL1对ATF4 mRNA的m7G修饰及稳定性调控，并检测ATF4蛋白表达及临床相关性。
ATF4过表达对METTL1敲低cSCC细胞代谢和功能的影响
验证ATF4是否介导METTL1对cSCC细胞糖酵解和肿瘤进展的影响。
在METTL1敲低细胞中过表达ATF4，检测OCR和ECAR、葡萄糖消耗、ATP产生、乳酸水平、糖酵解相关蛋白（GLUT1、HK2、LDHA），并检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。
ATF4过表达对体内METTL1敲低肿瘤生长的验证
确认ATF4过表达在体内逆转METTL1敲低的抗肿瘤效应。
将METTL1敲低并过表达ATF4的HSC-1和A431细胞注射到裸鼠，监测肿瘤生长和重量，并检测PCNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | TargetMOI | C005 |
| EdU Apollo DNA体外试剂盒 | Beyotime | C0071S | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V/PI凋亡检测试剂盒 | Solarbio | CA1012 |
| TUNEL染色试剂盒 | Servicebio | G1504 | |
| Western blot | METTL1抗体 | Abcam | ab271063 |
| ATF4抗体 | Abcam | ab216839 | |
| PCNA抗体 | CST | 13110 | |
| BCL-2抗体 | BIOSS | bs-0032R | |
| BAX抗体 | BIOSS | bsm-33283M | |
| β-微管蛋白抗体 | CST | 2146 | |
| Chemiscope 6000 pro touch成像系统 | -- | -- | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | -- | -- |
| mRNA分离 | Dynabeads mRNA纯化试剂盒 | Invitrogen | 61006 |
| mRNA decapping | 烟草脱帽酶 | Enzymax | 94 |
| Dot blot | 抗m7G抗体 | Abcam | ab300740 |
| MeRIP-qPCR | Magna RIP试剂盒 | Millipore | 17-700 |
| 抗M7G抗体 | -- | -- | |
| IgG磁珠 | Sigma-Aldrich | 16-663 | |
| 代谢分析 | Seahorse XF细胞培养微孔板 | Agilent | -- |
| 安捷伦Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1试剂盒 | MKBio | MX3203 |
| 线粒体质量检测 | MitoTracker Green FM染料 | MKBio | MX4309 |
| 流式分析 | BD FACS Celesta流式细胞仪 | BD | -- |
| 葡萄糖检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Nanjing JianCheng Bioengineering Institute | A154-2-1 |
| ATP检测 | ATP产生试剂盒 | Nanjing JianCheng Bioengineering Institute | A095-1-1 |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | Nanjing JianCheng Bioengineering Institute | A019-2-1 |
| 荧光素酶报告基因 | pSI-CHECK2荧光素酶载体 | Hanbio Biotechnology | -- |
| pGL3-HK2启动子 | Hanbio Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本 | 组织芯片胸围号HSkiC060PT01，cSCC标本36例，正常皮肤7例 阅读提示：Materials and methods - Patient samples |
| 细胞培养 | 细胞系：HSC-1, A431, HaCaT；培养基：DMEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素；培养条件：37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and methods - Cell lines and cell culture |
| METTL1敲低 | shRNA序列：shMETTL1-1 (GGTGTATACCATAACCGATGT)；筛选浓度：1 μg/mL嘌呤霉素 阅读提示：Materials and methods - Lentivirus infection and cell transfection, Table 2 |
| 体内实验 | 雌性BALB/c裸鼠，6周龄；细胞接种数：5×10^6；皮下注射；监测30天 阅读提示：Materials and methods - Xenograft tumorigenesis model |
| 机制验证 | MeRIP-qPCR使用Magna RIP试剂盒（17-700）和抗m7G抗体；RNA稳定性实验使用放线菌素D（10 μg/mL）处理0、3、6小时 阅读提示：Materials and methods - MeRIP-qPCR, RNA stability assay |