细胞培养与原位固定
在保持释放的EVs于原始微环境的前提下，观察细胞释放MV-lEVs及其破裂过程。
将细胞培养在明胶-纤连蛋白包被的玻璃片上，原位固定（4% PFA）后通过共聚焦和电镜观察。
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通过整体释放的amphisomes（amphiectosomes）的限膜破裂释放小细胞外囊泡的“破袋机制”
A 'torn bag mechanism' of small extracellular vesicle release via limiting membrane rupture of en bloc released amphisomes (amphiectosomes).
实验完整度
高结合透射电镜、共聚焦、超分辨活细胞成像、免疫金标记等多种手段，在体外细胞系和体内组织（小鼠肾和肝）中验证了MV-lEVs的释放及破裂机制，并进行了功能调控实验。
主要模型
HEK293T-PalmGFP细胞 HT29细胞 HepG2细胞 小鼠肾脏和肝脏组织
重点核对
细胞系：HEK293T-PalmGFP、HT29、HepG2等，以及小鼠肾和肝组织 观察方法：透射电镜、共聚焦显微镜、STED超分辨显微镜、活细胞成像（SIM2） 关键处理：使用30 μM Chloroquine、10 nM Bafilomycin A1、125 ng/mL Cytochalasin B、250 pg/mL Colchicine、50 ng/mL Rapamycin处理细胞 检测指标：MV-lEVs的释放频率、ILVs的CD63和LC3B标记、LC3II蛋白水平
摘要
最近的研究表明细胞外囊泡（EV）生物发生途径具有意想不到的复杂性。我们之前发现人类结直肠癌细胞在体内整体释放大的多泡体样结构。在这里，我们测试了这种大型EV类型是否仅限于结直肠癌细胞。我们发现我们研究的所有细胞类型（包括不同的细胞系和其原始组织环境中的细胞）都释放多泡大型EV（MV-lEVs）。我们还证明，当MV-lEVs的限膜自发破裂时，其腔内囊泡（ILVs）通过“破袋机制”逃逸到细胞外环境。我们证明了MV-lEVs是通过amphisomes的外溢作用释放的（因此，我们将其称为amphiectosomes）。amphiectosomes的ILVs和从条件培养基中分离的小EV都仅呈CD63或LC3B阳性。根据我们的模型，当多泡体与自噬体融合时，自噬体内膜片段卷曲形成amphisomes的LC3B阳性ILVs，而CD63阳性小EV则来自多泡体。我们的数据提示了一种新的小EV通用释放机制，不同于多泡体或amphisomes的胞吐作用，也不同于小外吐体释放途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究探讨了多泡大型细胞外囊泡（MV-lEVs）的释放是否特异于结直肠癌细胞，并探究其释放机制及其腔内囊泡（ILVs）的来源。
- 核心机制
- MV-lEVs由amphisomes通过胞外分泌（ectocytosis）释放，称为amphiectosomes；其外膜破裂（“破袋机制”）导致ILVs释放为小细胞外囊泡（sEVs）。ILVs具有两种来源：CD63阳性来自多泡体，LC3B阳性来自自噬体内膜片段。
- 主要证据
- 通过透射电镜在多种细胞系和小鼠肾肝组织中观察到MV-lEVs释放及破裂释放ILVs的现象；通过共聚焦和免疫电镜证实ILVs呈CD63或LC3B阳性；通过活细胞成像和STED超分辨显微镜观察LC3阳性ILVs释放和amphisome形成过程；药物处理实验表明微管、自噬溶酶体途径调控amphiectosome释放。
- 研究意义
- 该研究提出一种新的sEV生物发生机制，不同于经典的MVB或amphisome胞吐作用和小外吐体途径，对理解sEV的普遍释放机制具有潜在重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
透射电镜观察MV-lEVs释放及破裂
在超微结构水平检测各细胞类型和小鼠组织中MV-lEVs的出芽、分泌和破裂释放ILVs。
使用4%戊二醛固定、锇酸后固定、Epon或LR White树脂包埋，制备超薄切片，透射电镜观察。
免疫荧光标记及共聚焦分析
检测MV-lEVs及其ILVs的蛋白标记物（CD63、CD81、ALIX、TSG101、LC3B、Rab7、TSPAN4），确定其亚细胞来源。
原位固定后，使用抗体进行免疫荧光标记，通过共聚焦显微镜观察和共定位分析。
免疫电镜分析ILVs标记
在超微结构水平确认ILVs的CD63和LC3B标记情况。
使用LR White树脂包埋的样品进行免疫金标记，透射电镜观察。
活细胞成像监测破袋机制
实时动态观察LC3阳性sEVs从amphiectosomes释放的过程，排除固定假象。
使用HEK293T-PalmGFP-LC3RFP细胞，在共聚焦或SIM2超分辨显微镜下连续成像，观察LC3阳性颗粒释放。
药物调节amphiectosome释放
通过药物抑制或激活自噬、微管、肌动蛋白等途径，探究amphiectosome释放的调控机制。
在血清存在的培养基中，细胞分别用不同药物处理，然后原位固定，共聚焦显微镜计数MV-lEVs数目并分析。
蛋白质印迹验证LC3II
验证自噬标志物LC3II在sEV中的存在及其在Chloroquine处理下的变化。
从无血清条件培养基中分离细胞、血清和大型EV，TCA沉淀总蛋白，进行Western blot检测LC3II。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| Claycomb培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | BioSera | -- | |
| 青霉素 | Sigma | -- | |
| 链霉素 | Sigma | -- | |
| 明胶 | Sigma | -- | |
| 纤连蛋白 | Invitrogen | -- | |
| Flux细胞培养载玻片 | SPL | -- | |
| 细胞转染 | LentiBrite RFP-LC3慢病毒生物传感器 | Merck | 17-10143 |
| 免疫荧光 | 抗CD63抗体（兔多克隆） | Sigma/Merck | SAB2109138 |
| 抗CD63抗体（小鼠单克隆） | Santa Cruz Biotechnology | sc-5275 | |
| 抗CD81抗体（兔多克隆） | Sigma/Merck | SAB3500454 | |
| 抗CD81抗体（小鼠单克隆） | Invitrogen | MA5-13548 | |
| 抗TSG101抗体 | Sigma/Merck | HPA006161 | |
| 抗ALIX抗体 | Sigma/Merck | SAB420047 | |
| 抗LC3B抗体（兔单克隆） | Sigma/Merck | ZRB100 | |
| 抗LC3A抗体 | Sigma/Merck | ZRB1125 | |
| 抗TSPAN4抗体 | Bioss | BS-9413R | |
| 抗Rab7抗体 | Sigma/Merck | R8779 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma/Merck | T9026 | |
| 抗GFP抗体 | Sigma/Merck | G6539 | |
| 抗RFP抗体 | Invitrogen | MA5-15257 | |
| 山羊抗小鼠IgG-ATTO550 | Sigma/Merck | 43394 | |
| 山羊抗兔IgG-ATTO647N | Sigma/Merck | 40839 | |
| STED显微镜 | 山羊抗小鼠Star 635P | Abberior | ST635P-1001-500UG |
| 山羊抗兔Star 580 | Abberior | ST580-1002-500UG | |
| Western blot | 抗兔IgG Fc（HRP） | abcam | ab97200 |
| 抗小鼠IgG Fc（HRP） | abcam | ab97265 | |
| 免疫电镜 | 山羊多克隆抗兔IgG（全分子）10 nm金预吸附 | abcam | ab27234 |
| 山羊多克隆抗小鼠IgG（全分子）5 nm金预吸附 | Sigma/Merck | G7527 | |
| 活细胞标记 | CF488A偶联麦胚凝集素（WGA） | Biotium | 29022-1 |
| 药物处理 | 巴弗洛霉素A1 | Sigma/Merck | B1793 |
| 秋水仙碱 | Serva | 77120.02 | |
| 磷酸氯喹 | Invitrogen | P36236 C | |
| 雷帕霉素 | Sigma/Merck | R0395 | |
| 细胞松弛素B | Sigma | C2743 | |
| sEV纯化 | TFF Easy切向流过滤系统 | HansaBioMed Life Sciences | HBM-TFF/1 |
| 透射电镜 | Epon树脂 | Electron Microscopy Sciences | -- |
| LR White低粘度树脂 | SPI Supplies | -- | |
| 醋酸铀酰 | -- | -- | |
| 柠檬酸铅 | -- | -- | |
| JEOL 1011透射电子显微镜 | JEOL | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 任何kDa预制胶 | Bio-Rad | -- | |
| MiniProtean凝胶电泳系统 | Bio-Rad | -- | |
| PVDF膜 | Serva | -- | |
| ECL蛋白质印迹底物 | Thermo Scientific | -- | |
| Imager CHEMI Premium成像系统 | VWR | -- | |
| 共聚焦显微成像 | Leica SP8 Lightning共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| STED显微镜 | Abberior Instruments Facility Line STED显微镜 | Abberior Instruments | -- |
| Olympus IX83显微镜基座 | Olympus | -- | |
| UPLXAPO60XO油浸物镜 | Olympus | -- | |
| 活细胞成像 | Zeiss ELYRA 7 晶格SIM²超分辨显微镜 | Zeiss | -- |
| 细胞分选 | HS800细胞分选仪 | SONY | -- |
| 细胞培养耗材 | 玻璃盖玻片 | VWR | -- |
| 活细胞成像 | 10孔盖玻片底腔室载玻片 | Greiner-BioOne | -- |
| 染色封片 | ProLong Diamond抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen | -- |
| STED显微镜 | SlowFade Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo | -- |
| 细胞染色 | Triton X-100 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | 乳脂肪球表皮生长因子8-ATTO488偶联物 | abcam | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系培养条件：DMEM（HEK293、HEK293T-PalmGFP、HepG2、H9c2）、RPMI 1640（HT29）、Claycomb medium（HL1）；培养基中添加10% FBS、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素；培养表面包被0.02%明胶和5 mg/mL纤连蛋白 阅读提示：Materials and methods: Cell lines |
| 原位固定与免疫荧光 | 4% PFA固定20分钟；用50 mM甘氨酸-PBS洗涤；封闭透化液含10% FBS和0.1% Triton X-100；一抗1:200，二抗1:1000；共定位分析使用LASX软件，阈值20% 阅读提示：Materials and methods: Confocal microscopy |
| 透射电镜样品制备 | 4%戊二醛固定48小时（4℃），1%锇酸后固定2小时；Epon或LR White树脂包埋；超薄切片60 nm；醋酸铀酰和柠檬酸铅染色 阅读提示：Materials and methods: Transmission electron microscopy |
| 活细胞成像 | HEK293T-PalmGFP-LC3RFP细胞；30 μM Chloroquine处理过夜；使用Zeiss Elyra7 SIM2超分辨显微镜，×63油镜；环境控制腔室 阅读提示：Materials and methods: Live-cell imaging |
| 药物处理实验 | Chloroquine 30 μM、Bafilomycin A1 10 nM、Cytochalasin B 125 ng/mL、Colchicine 250 pg/mL、Rapamycin 50 ng/mL；处理时间：大部分药物过夜，Colchicine为1小时；分析前原位固定 阅读提示：Materials and methods: Modulation of amphiectosome release |
| Western blot | 细胞、血清和大型EV去除的条件培养基；TCA沉淀总蛋白；20 µg蛋白上样；10%凝胶或Any kDa预制胶；一抗稀释度需核查 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |