REA蛋白制备与表征
获得高纯度、低内毒素的重组REA蛋白，以用于后续实验。
从MTB基因组扩增ESAT6、Ag85B、Rv2299c基因，克隆入pET22b(+)载体，转化大肠杆菌BL21，经Ni-NTA纯化，去除内毒素。
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新型融合蛋白REA在小鼠中诱导针对结核病的强大初次保护作用。
Novel fusion protein REA induces robust prime protection against tuberculosis in mice.
实验完整度
高包含体外细胞实验（BMDM/BMDC）、体内小鼠模型（H37Ra/H37Rv攻击）、组织病理学、免疫组织化学及多指标流式分析等多个层级，并进行机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠 骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 骨髓来源树突状细胞（BMDC） OT-II TCR转基因小鼠CD4+ T细胞
重点核对
REA剂量：5 μg，皮下注射三次，间隔2周 MTB H37Rv挑战剂量：1×10^4 CFU，气管内感染 BCG对照：1×10^5 CFU，单次皮下注射 感染后时间点：6周和16周 佐剂：DDA 250 μg + MPL 25 μg
摘要
虽然许多新型结核病疫苗候选物目前正在进行临床前或临床试验，但均无法完全清除感染。在本研究中，我们设计了一种强效的嵌合蛋白疫苗候选物Rv2299cD2D3-ESAT-6-Ag85B (REA)，其通过树突状细胞成熟诱导Th1和Th17反应。REA激活的巨噬细胞通过(PI3K)–p38 MAPK-Ca2+-NADPH oxidase途径启动结核分枝杆菌(MTB)的杀伤机制，如吞噬体成熟和吞噬溶酶体融合。REA激活的树突状细胞和巨噬细胞引发了协同的抗分枝杆菌反应。值得注意的是，REA免疫小鼠在感染后16周将MTB生长抑制至无法检测的水平，这得到了肺组织的肉眼和病理学发现以及抗酸染色的支持，并维持了抗原特异性多功能IFN-γ+IL-2+TNF-α CD4+ T细胞和组织中产生细胞因子的长效T细胞。我们的研究结果表明，REA是一种针对结核病的优秀初次预防性疫苗候选物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估新型融合蛋白REA作为结核病疫苗候选物的保护效果及其免疫机制。
- 核心机制
- REA通过PI3K–p38 MAPK-Ca2+-NADPH oxidase途径促进吞噬体成熟和吞噬溶酶体融合，激活巨噬细胞杀菌，并诱导DC成熟，引发Th1/Th17反应。
- 主要证据
- REA免疫小鼠在H37Rv攻击后16周肺和脾中细菌不可检测，伴随组织病理学改善和多功能CD4+ T细胞及M1极化维持。
- 研究意义
- REA作为一种亚单位疫苗，在动物模型中展现了前所未有的清除MTB的能力，为开发新型结核病疫苗提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外APC活化检测
评估REA对BMDM和BMDC的活化能力及诱导T细胞极化的倾向。
用不同浓度REA刺激BMDM/BMDC，检测细胞因子分泌和表面分子表达，并与OT-II CD4+ T细胞共培养检测增殖和细胞因子。
巨噬细胞杀菌机制研究
阐明REA促进巨噬细胞吞噬体成熟及杀菌的信号通路。
MTB感染BMDM后，检测吞噬体标志物共定位、信号通路磷酸化、ROS/NO产生，并使用抑制剂验证通路依赖性。
体内免疫原性评估
评估REA免疫小鼠后诱导的抗原特异性T细胞反应。
免疫小鼠后6周取脾细胞，用REA或组分蛋白刺激，检测细胞因子产生。
保护效力实验（H37Ra挑战）
初步评估REA作为初次疫苗在温和菌株挑战下的保护效果。
免疫小鼠后用H37Ra气管内攻击，14周后检测器官细菌载量及T细胞反应。
保护效力实验（H37Rv挑战）
验证REA在毒力菌株挑战下的长期保护效果。
免疫小鼠后用H37Rv气管内攻击，在6周和16周检测细菌载量、组织病理、免疫细胞浸润及多功能T细胞。
免疫细胞表型分析
分析肺组织中巨噬细胞极化状态和APC数量变化。
用免疫组化染色检测F4/80, iNOS, Arg-1, CD163等标志物，计算M1/M2比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Welgene | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 白细胞介素-4 | -- | -- | |
| 细菌培养 | 7H9培养基 | -- | -- |
| 吐温-80 | Sigma | -- | |
| OADC增菌液 | Sigma | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | pET22b(+)载体 | Novagen | -- |
| Ni-NTA树脂 | -- | -- | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Pierce | -- | |
| 内毒素检测 | LAL检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Laboratories | -- |
| Annexin V/PI凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| LDH检测试剂盒 | Takara | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | eBioscience | -- |
| ROS检测 | H2DCFDA荧光探针 | Molecular Probes | -- |
| 流式细胞术 | FACS Canto II流式细胞仪 | -- | -- |
| NovoCyte流式细胞仪 | -- | -- | |
| CFSE染料 | Invitrogen | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Scientific | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | BioRad | -- | |
| 细菌计数 | 7H10琼脂 | -- | -- |
| 溶酶体检测 | LysoTracker Green DND-26溶酶体探针 | Molecular Probes | -- |
| 钙离子检测 | Fluo-4/AM钙离子荧光探针 | -- | -- |
| 抑制剂处理 | SB203580 | -- | -- |
| LY294002 | -- | -- | |
| BAPTA-AM | -- | -- | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | -- | -- | |
| 二苯基氯化碘盐 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗Rab5抗体 | -- | -- |
| 抗hVPS34抗体 | -- | -- | |
| 抗EEA1抗体 | -- | -- | |
| 抗Rab7抗体 | -- | -- | |
| 抗LAMP1抗体 | -- | -- | |
| 动物实验 | 阿佛丁 | Sigma | -- |
| 二甲基双十八烷基铵脂质体 | Sigma | -- | |
| 单磷酰脂质A | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BMDM和BMDC的诱导分化条件（如M-CSF浓度、培养天数） 阅读提示：参见Methods中Cell culture部分 |
| 蛋白处理 | REA的浓度（如5 μg/ml），LPS浓度（100 ng/ml） 阅读提示：参见Methods中相关实验部分及图例 |
| MTB感染 | 感染复数（MOI=1），感染时间（4小时），胞外菌清除剂（kanamycin或amikacin） 阅读提示：参见Methods中Intracellular survival of MTB部分 |
| 体内免疫 | 免疫剂量（5 μg REA），免疫次数（3次），间隔（2周），注射途径（皮下），佐剂组成（DDA 250 μg + MPL 25 μg） 阅读提示：参见Methods中Immunization部分 |
| 攻击感染 | 攻击菌株（H37Ra或H37Rv），剂量（H37Ra: 1×10^6 CFU; H37Rv: 1×10^4 CFU），途径（气管内），时间（末次免疫后6周） 阅读提示：参见Methods中Challenge部分 |
| 组织处理 | 组织固定、切片、染色方法（HE, AFB, IHC） 阅读提示：参见Methods中Histopathology部分 |