细胞分离与永生化
获取并建立多种人肺细胞类型，以模拟肺组织的细胞多样性。
从手术切除的正常肺组织中分离基质细胞，获取小气道上皮细胞、巨噬细胞和HUVECs，并用SV40大T抗原转染实现永生化。
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先进肺芯片技术：模拟复杂的人类肺微环境
Advanced Lung-on-a-Chip Technology: Mimicking the Complex Human Lung Microenvironment.
实验完整度
高包含体外细胞培养、芯片构建及功能验证、SERPINB2敲低等功能验证、RNA-seq及GEO数据集验证。
主要模型
人小气道上皮细胞 人肺基质细胞（成纤维细胞） 人巨噬细胞 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）
重点核对
芯片由PDMS制成，尺寸为70×100×7 mm，气道腔直径3 mm 天然聚合物混合物：透明质酸和胶原蛋白（各24 mg/ml）与纤维蛋白原（50 mg/ml）和凝血酶（5 U/ml） 细胞密度约2×10^5 cells/ml 使用SV40大T抗原永生化细胞 毒性暴露条件：二噁英5或7 ng/ml处理72小时
摘要
各种肺细胞类型之间复杂的相互作用对于协调多种生理过程至关重要。传统的二维和最近的三维（3D）测定平台无法精确复制这些复杂的通讯。许多体外肺模型不能有效反映肺组织的多细胞复杂性。在此，我们构建了一个先进的多细胞3D肺芯片系统，该系统能够适当地复制动态的肺微环境及其复杂的微结构。将多种肺细胞整合到由天然聚合物（包括胶原蛋白和透明质酸）混合物以及作为天然交联剂的血液凝固因子构成的微结构中。该系统准确反映了肺的复杂3D结构。生物标志物对有毒物质的反应比功能指标（如细胞增殖和凋亡）更快速、更灵敏。SERPINB2被确定为肺毒性生物标志物；它在暴露于各种有毒物质的小气道上皮细胞中被激活。然后，我们开发了一种荧光连接的毒性生物标志物筛选平台，该平台通过测量转换后的荧光信号强度，能够直观且定量地评估肺毒性。这种荧光标记系统被整合到芯片平台内的小气道上皮细胞中；使得肺芯片能够评估候选药物的肺毒性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何构建一个能够准确模拟人类肺组织复杂结构和多细胞相互作用，并快速灵敏评估候选药物肺毒性的体外平台？
- 核心机制
- SERPINB2被确定为肺毒性的生物标志物，其表达在暴露于有毒物质时上调，并介导细胞凋亡、生长抑制和迁移抑制。
- 主要证据
- RNA-seq鉴定出在二噁英处理的小气道上皮细胞中SERPINB2上调，并通过qPCR和Western blot验证；SERPINB2敲低逆转了二噁英诱导的细胞生长抑制、迁移抑制和凋亡；GEO数据集分析显示SERPINB2在多种毒性物质暴露下上调。
- 研究意义
- 该平台提供了准确和快速的毒性数据，能够识别传统单层细胞模型甚至先进3D药物评估系统难以发现的候选药物潜在有害效应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
芯片制造
构建具有多隔室结构的PDMS芯片，以模拟肺组织结构。
使用CAD设计和3D打印制作PLA模具，注入PDMS并聚合，脱模得到芯片。
细胞装载与支架形成
将多种肺细胞整合到天然聚合物支架中，以模拟肺微环境。
将细胞与透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白原和凝血酶混合物装载到芯片相应隔室中，聚合形成组织支架。
物理特性表征
评估组织支架的微结构、机械强度和流变学特性。
通过SEM观察微孔结构，万能试验机测量压缩强度，流变仪测量粘度，溶胀测试。
细胞活力与功能分析
评估封装细胞的长期存活、代谢活性和表型维持。
使用Live/Dead分析、CCK-8实验检测细胞活力和代谢；免疫染色和实时PCR分析细胞特异性标志物表达。
功能性分泌检测
验证芯片中细胞的功能如粘液产生和基质蛋白分泌。
通过免疫染色和qPCR检测MUC5AC, MUC5B, SPDEF；通过ELISA检测纤连蛋白和层粘连蛋白分泌。
毒性标志物鉴定
识别肺毒性生物标志物。
对二噁英暴露的小气道上皮细胞进行RNA-seq分析，并验证SERPINB2上调，通过qPCR和Western blot确认。
SERPINB2敲低验证
验证SERPINB2在毒性效应中的功能。
使用shRNA敲低SERPINB2，评估对细胞增殖、迁移、凋亡及MMP-2/9表达的影响。
开发荧光筛选平台
建立基于GFP报告基因的可视化和定量肺毒性筛选平台。
在SERPINB2启动子中整合GFP基因，转染小气道上皮细胞，并集成到芯片中，测量荧光信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 芯片制造 | Sylgard 184 聚二甲基硅氧烷 | Dow Corning Corp. | -- |
| 3D打印 | Master EV 3D打印机 | Carima | -- |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | WELGENE Biotech | LM001-05 |
| 小气道上皮细胞生长基础培养基 | Lonza | CC-4124 | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 内皮细胞生长基础培养基-2 | Lonza | -- | |
| 内皮生长培养基-2生长添加物 | Lonza | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| I型胶原蛋白 | -- | -- | |
| 透明质酸 | -- | -- | |
| 纤维蛋白原 | -- | -- | |
| 凝血酶 | -- | -- | |
| I型胶原酶 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | 活/死细胞检测试剂盒 | Invitrogen | L3224 |
| CCK-8检测试剂盒 | Abbkine | KTC011001 | |
| 溴化乙锭同源二聚体-1 | -- | -- | |
| 钙黄绿素AM | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 细胞成像 | EVOS FL 细胞成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫染色 | Triton X-100 | -- | -- |
| 正常猪血清 | DAKO | -- | |
| 抗GFP抗体 | Invitrogen | V820-20 | |
| 抗PECAM1抗体 | R&D Systems | BBA7 | |
| 抗vWF抗体 | Abcam | ab6994 | |
| 抗波形蛋白抗体 | BD Biosciences | 550513 | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Abcam | ab2413 | |
| 抗细胞角蛋白18抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32329 | |
| 抗细胞角蛋白19抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376126 | |
| 抗CD68抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20060 | |
| 抗CD11b抗体 | Abcam | ab52478 | |
| 抗COL1A1抗体 | Invitrogen | PA5-29569 | |
| 抗层粘连蛋白α1抗体 | Invitrogen | PA1-16730 | |
| 抗MUC5AC抗体 | Abcam | ab198294 | |
| 抗MUC5B抗体 | Invitrogen | 37-7400 | |
| 抗SPDEF抗体 | Bioss | BS-1866R | |
| 免疫荧光检测 | LSM 510 Meta 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| RT-qPCR | TRIzol 试剂 | Invitrogen Life Technologies | -- |
| SuperScript II 逆转录酶 | Invitrogen Life Technologies | -- | |
| Express SYBR Green qPCR 预混液 | BioPrince | -- | |
| Rotor-Gene Q 实时PCR仪 | QIAGEN | -- | |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- |
| 抗SERPINB2抗体 | Abcam | ab47742 | |
| 抗MMP-2抗体 | Cell Signaling Technology | 4022 | |
| 抗MMP-9抗体 | Cell Signaling Technology | 13667 | |
| 抗caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab189073 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | BD Pharmingen | 554021 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | BD Pharmingen | 554002 | |
| 迁移实验 | Transwell 板 | Corning Inc. | -- |
| ELISA | 纤连蛋白ELISA试剂盒 | RayBiotech | ELH-FN1 |
| 层粘连蛋白ELISA试剂盒 | RayBiotech | ELH-LAMA4 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen | 52887 |
| Opti-MEM 培养基 | Gibco | -- | |
| SEM | EVO®LS10 扫描电子显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 离子溅射仪 1010 | Hitachi | -- | |
| 流变学测量 | MCR 102 流变仪 | Anton Paar | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 芯片制造 | PDMS混合比例（20:3）、固化温度（65°C）和时间（24小时）、模具材料（PLA） 阅读提示：Materials and Methods: Construction of lung-on-a-chip platform; Fabrication procedure |
| 细胞培养与永生化 | 原代细胞来源、永生化方法（SV40大T抗原）、培养基和添加剂 阅读提示：Materials and Methods: Isolation and establishment of human lung tissue constituent cells |
| 组织支架制备 | 天然聚合物浓度（透明质酸24 mg/ml、胶原蛋白24 mg/ml）、凝血因子浓度（纤维蛋白原50 mg/ml、凝血酶5 U/ml）、细胞密度（2×10^5 cells/ml） 阅读提示：Materials and Methods: Incorporating diverse types of lung tissue cells |
| 细胞活力与代谢检测 | Live/Dead染色浓度和孵育时间、CCK-8孵育时间（4小时）和检测波长（450 nm）、时间点（1,7,14,21,28天） 阅读提示：Materials and Methods: Evaluation of extended cell viability; Assessment of prolonged metabolic activities |
| 毒性实验（SERPINB2敲低） | shRNA浓度（3 μg/ml）、Lipofectamine 2000用量（3 μl）、二噁英浓度（5 ng/ml）、处理时间（72小时） 阅读提示：Materials and Methods: Targeted suppression of SERPINB2 via specific shRNAs; Figure 7 legend |
| 荧光检测平台 | GFP构建、毒素种类和浓度（如二噁英5 ng/ml）、荧光信号测量方法 阅读提示：Results: Establishment of a luminescent dye-linked toxicity reporter platform; Figure 8 and 9 legends |