纳米载体合成与表征
制备并表征不同类型的荧光标记纳米载体
制备MC3-LNP、脂质体、多聚复合物、DNA折纸、AAV等，并进行粒径、电位、包封率等表征。
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深度学习在单细胞分辨率下对整个小鼠体内纳米载体的成像
Nanocarrier imaging at single-cell resolution across entire mouse bodies with deep learning.
实验完整度
高包含体外模型（细胞培养）、体内动物模型（小鼠）、患者样本（未提及）、组学数据（蛋白质组学），并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠 MC3-LNP DNA折纸 AAV2变体Retro-AAV
重点核对
LNP给药剂量：文中未明确说明 LNP给药途径：肌肉注射、静脉注射等 组织透明化方法：优化的DISCO 深度学习模型：3D U-Net 蛋白质组学样本：心脏区域
摘要
高效且准确的纳米载体开发用于靶向药物递送受到缺乏分析其在整个生物体内细胞水平生物分布方法的阻碍。这里我们介绍了单细胞精度纳米载体鉴定（SCP-Nano），一种整合实验和深度学习的流程，用于在单细胞分辨率下全面量化纳米载体在整个小鼠体内的靶向性。SCP-Nano揭示了脂质纳米颗粒（LNPs）在不同注射途径下低至0.0005 mg kg−1剂量（远低于传统全身成像技术的检测限）的组织分布模式。我们证明，肌肉注射携带SARS-CoV-2刺突mRNA的LNPs可到达心脏组织，导致蛋白质组变化，提示免疫激活和血管损伤。SCP-Nano可推广到多种类型的纳米载体，包括脂质体、多聚复合物、DNA折纸和腺相关病毒（AAVs），揭示了一种AAV2变体转导全身脂肪细胞。SCP-Nano能够以高灵敏度对小鼠体内的纳米载体分布进行全面三维映射，应能加速基于纳米载体的精准和安全疗法的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现单细胞分辨率下对整个小鼠体内纳米载体生物分布的高灵敏度成像和量化？
- 核心机制
- SCP-Nano结合优化的组织透明化和深度学习分割算法，可检测低至0.0005 mg/kg剂量的LNP分布；发现肌肉注射LNP-mRNA可靶向心脏内皮细胞，并引起蛋白质组变化，涉及免疫和血管相关通路。
- 主要证据
- 通过优化的DISCO透明化和光片显微镜成像，结合深度学习模型（3D U-Net）分割和量化，在多种纳米载体（LNP、脂质体、多聚复合物、DNA折纸、AAV）中验证了SCP-Nano的泛化能力，并通过蛋白质组学分析心脏组织变化。
- 研究意义
- SCP-Nano为纳米载体的临床转化提供高灵敏度的全身细胞级分布评估，有助于识别脱靶效应，加速精准和安全的纳米疗法开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
动物给药与组织透明化
在小鼠体内施用纳米载体并使组织透明以便成像
通过不同途径（静脉、肌肉、鼻内等）注射纳米载体，在特定时间点灌注固定并进行优化的DISCO透明化处理。
全身成像与深度学习分析
获取全身图像并量化纳米载体靶向细胞
使用光片显微镜采集全身图像，利用深度学习模型（3D U-Net）分割靶向细胞，并量化分布。
验证mRNA表达与蛋白质组学分析
确认LNP递送mRNA的表达并研究脱靶组织分子变化
使用纳米抗体染色检测EGFP或Spike蛋白表达，对心脏组织进行质谱蛋白质组学分析。
DNA折纸和AAV靶向验证
验证SCP-Nano对其他纳米载体的适用性及靶向细胞类型
注射DNA折纸或AAV载体，进行全身体成像和免疫组化验证细胞类型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| LNP合成 | DLin-MC3-DMA | MedKoo Biosciences | 555308 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 | Sigma-Aldrich | 850365P | |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DMG-PEG-2000 | Sigma-Aldrich | 880151P | |
| Pur-A-Lyzer Midi透析试剂盒 | Sigma-Aldrich | PURD35030 | |
| mRNA生产 | EGFP mRNA | RiboPro | -- |
| Spike mRNA | RiboPro | -- | |
| Alexa Fluor 647标记的EGFP mRNA | RiboPro | -- | |
| FLuc mRNA | RiboPro | -- | |
| 免疫染色 | Alexa Fluor 568偶联抗GFP纳米抗体 | ChromoTek | gb2AF568-50 |
| Alexa Fluor 647偶联抗GFP纳米抗体 | ChromoTek | gb2AF647 | |
| 细胞核染色 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4864 |
| 生物发光成像 | VivoGlo荧光素 | Promega | -- |
| AAV注射 | Retro-AAV | Addgene | 37825-AAVrg |
| PHP.eB-AAV | Addgene | 37825-PHPeB | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 16210072 | |
| 肝素 | Merck | H4784-250MG | |
| 抗FGFR1抗体 | Invitrogen | PA5-86349 | |
| 抗整合素αVβ5抗体 | Bioss | BS-1356R | |
| 抗AAVR抗体 | Proteintech | 21016-1-AP | |
| 免疫染色 | 抗脂滴包被蛋白-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3470 |
| GFP-Booster Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | 17363333 | |
| 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | |
| 大鼠抗CD45抗体 | BD Biosciences | 14-0451-82 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗大鼠IgG（H+L） | Thermo Fisher Scientific | A-11077 | |
| 小鼠抗肌钙蛋白T抗体 | Abcam | ab8295 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗小鼠IgG（H+L） | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| 小鼠抗Podocalyxin抗体 | R&D Systems | MAB1556 | |
| 兔抗α-SMA抗体 | Abcam | ab5694 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | |
| 光学成像 | Leica TCS SP8显微镜 | Leica | -- |
| Zeiss LSM710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 光片成像 | UltraMicroscope Blaze | Miltenyi Biotec | -- |
| ImSpector软件 | Miltenyi Biotec | 7.3.2 | |
| 蛋白质组学 | EASY nanoLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| timsTOF SCP | Bruker Daltonik | -- | |
| Aurora Elite UHPLC色谱柱 | -- | -- | |
| 高通量μPAC Neo HPLC色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Pierce定量比色肽测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | Nunc Lab-Tek II腔室盖玻片 | Nunc | Z734853 |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| IBMX | -- | -- | |
| 吲哚美辛 | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 罗格列酮 | -- | -- | |
| DNA折纸生产 | Triton X-114 | -- | -- |
| Endosafe nexgen-PTS | Charles River Laboratories | -- | |
| PEG-聚赖氨酸 | Alamanda Polymers | -- | |
| LNP合成 | SM-102 | -- | -- |
| ALC-0315 | -- | -- | |
| DOTAP | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM 10% FBS | -- | -- |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | -- | |
| 蛋白质组学 | 胰蛋白酶-LysC | -- | -- |
| SpeedVac真空浓缩仪 | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Bioruptor Pico超声破碎仪 | -- | -- | |
| StageTips | 3M Empore | -- | |
| Evotip PURE | -- | -- | |
| 纳米载体合成 | Amicon Ultra离心过滤器 | Millipore | -- |
| Sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| proFIRE | Dynamic Biosensors | -- | |
| Atto 550 | ATTO-TEC | -- | |
| Atto 647N | ATTO-TEC | -- | |
| Atto 647 | ATTO-TEC | -- | |
| 支化聚乙烯亚胺（25 kDa） | -- | -- | |
| ssDNA-Alexa Fluor 647 | -- | -- | |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 | -- | -- | |
| 多柔比星脂质体 | -- | -- | |
| -- | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系、性别、年龄、来源 阅读提示：Methods: Animals |
| 纳米载体合成 | 脂质组成、摩尔比、mRNA与脂质比例、水化方法 阅读提示：Methods: LNP formulation |
| 给药方式 | 注射途径、剂量、注射体积、麻醉方法 阅读提示：Methods: Different nanocarriers administered to mice and dose calculations |
| 组织透明化 | DISCO方案的具体步骤、试剂浓度、处理时间 阅读提示：Methods: Optimized DISCO technique |
| 成像 | 显微镜型号、物镜倍数、z-step、曝光时间 阅读提示：Methods: Light sheet imaging |
| 深度学习分析 | 训练数据标注方式、模型架构、训练参数（patch size, batch size, learning rate） 阅读提示：Methods: Deep learning for LNP nanocarrier detection |
| 蛋白质组学 | 样本制备方法、LC-MS条件、数据处理参数 阅读提示：Methods: Sample preparation for mass spectrometry analysis及Liquid chromatography with tandem mass spectrometry |