CCDC113相互作用蛋白鉴定
验证CCDC113是否与轴丝相关蛋白CFAP57、CFAP91、TUBB5及N-DRC组分结合
在HEK293T细胞中共表达GFP-CCDC113与FLAG标签的CFAP57、CFAP91、TUBB5、DRC1、DRC2、DRC3，并通过免疫共沉淀检测相互作用。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CCDC113稳定精子轴丝和头尾耦合装置以确保雄性生育力
CCDC113 stabilizes sperm axoneme and head-tail coupling apparatus to ensure male fertility.
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9基因敲除小鼠模型、免疫共沉淀、透射电镜、免疫荧光等多种独立证据层级，并有明确的功能和机制验证。
主要模型
Ccdc113基因敲除小鼠 HEK293T细胞 小鼠附睾精子 人类精子
重点核对
Ccdc113基因敲除策略（CRISPR/Cas9，缺失10215 bp和插入64 bp） CCDC113与CFAP57、CFAP91、TUBB5、DRC1/2/3及SUN5、CENTLEIN的相互作用 Ccdc113-/-小鼠精子鞭毛和HTCA的超微结构变化 CCDC113在睾丸和精子中的定位 CCDC113在Sun5-/-、Centlein-/-和Pmfbp1-/-精子中的定位
摘要
精子的结构完整性对雄性生育力至关重要，精子头尾连接和鞭毛轴丝的缺陷与无头精子综合征（ASS）和精子鞭毛多形态异常（MMAF）相关。值得注意的是，头尾耦合装置（HTCA）受损常伴随鞭毛结构缺陷，然而这种现象背后的分子机制仍不清楚。在这里，我们鉴定了一个进化上保守的含卷曲螺旋结构域（CCDC）蛋白CCDC113，发现CCDC113的破坏导致精子鞭毛和HTCA紊乱，从而引起雄性不育。进一步分析显示，CCDC113能与CFAP57和CFAP91结合，并作为连接精子轴丝中放射辐、连接蛋白-动力蛋白调节复合体（N-DRC）和双微管（DMTs）的衔接蛋白。此外，CCDC113被鉴定为HTCA的结构组分，在精子发生过程中与SUN5和CENTLEIN协同连接精子头尾。总之，我们的研究揭示CCDC113在小鼠中作为精子轴丝和HTCA稳定的关键枢纽，为人类CCDC113突变相关的潜在不育发病机制提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCDC113在精子鞭毛轴丝和头尾耦合装置稳定性中的功能及其对雄性生育力的影响是什么？
- 核心机制
- CCDC113作为衔接蛋白连接放射辐、N-DRC和DMTs，稳定轴丝结构；同时与SUN5和CENTLEIN相互作用，维持HTCA的完整性。
- 主要证据
- Ccdc113敲除小鼠表现为精子鞭毛缺陷和头尾分离，透射电镜显示轴丝结构紊乱和HTCA异常，免疫共沉淀证明CCDC113与CFAP57/CFAP91/DRC2及SUN5/CENTLEIN相互作用，免疫荧光显示CFAP91和DRC2在Ccdc113-/-精子中不能与DMTs共定位。
- 研究意义
- 揭示CCDC113是小鼠精子轴丝和HTCA稳定的关键枢纽，为人类CCDC113突变导致的不育提供了潜在的发病机制见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Ccdc113敲除小鼠模型建立
探究CCDC113的生理功能
利用CRISPR/Cas9系统生成Ccdc113敲除小鼠，通过基因分型和免疫印迹确认敲除。
Ccdc113敲除小鼠生育力评估
确定Ccdc113敲除对雄性生育力的影响
将Ccdc113-/-雄性小鼠与野生型雌性小鼠交配，记录产仔数。
精子形态和鞭毛结构分析
观察Ccdc113敲除对精子形态和鞭毛结构的影响
通过H&E染色、PAS染色、免疫荧光和透射电镜分析附睾精子和睾丸精子。
HTCA结构分析
探究Ccdc113敲除对HTCA完整性的影响
通过透射电镜观察Ccdc113+/+和Ccdc113-/-精子细胞中HTCA的发育。
CCDC113与HTCA蛋白的相互作用
确认CCDC113是否与已知HTCA蛋白相互作用
在HEK293T细胞中共表达CCDC113与SUN5、CENTLEIN、PMFBP1、SPATA6，通过免疫共沉淀检测。
CCDC113在HTCA中的定位分析
阐明CCDC113在HTCA中的定位及其与SUN5和CENTLEIN的关系
免疫荧光染色观察CCDC113与SUN5、CENTLEIN的共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | -- | -- |
| CRISPR-Cas9系统 | Cyagen Biosciences | -- | |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | Stem Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | GNHu43 |
| 免疫印迹 | 兔抗CCDC113抗体 | Dia-an Biotech | -- |
| 小鼠抗α-微管蛋白抗体 | Abclonal | AC012 | |
| 小鼠抗GFP抗体 | Abmart | M20004 | |
| 兔抗MYC抗体 | EASYBIO | BE2011 | |
| 兔抗FLAG抗体 | Proteintech | 20543-1 | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗乙酰化微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T7451 |
| 小鼠抗α/β-微管蛋白抗体 | Abcam | ab44928 | |
| 兔抗DRC2抗体 | Novus | NBP2-84617 | |
| 兔抗CFAP91抗体 | Bioss | bs-9823R | |
| 小鼠抗SUN5抗体 | -- | -- | |
| 大鼠抗CENTLEIN抗体 | Absea Biotechnology Ltd | -- | |
| 兔抗SPATA6抗体 | Proteintech | 11849-1 | |
| Alexa Fluor 488偶联的凝集素PNA | Thermo Fisher | L21409 | |
| 山羊抗兔FITC | Zhong Shan Jin Qiao | ZF-0311 | |
| 山羊抗兔TRITC | Zhong Shan Jin Qiao | ZF-0316 | |
| 山羊抗小鼠FITC | Zhong Shan Jin Qiao | ZF-0312 | |
| 山羊抗小鼠TRITC | Zhong Shan Jin Qiao | ZF0313 | |
| 精子活力分析 | Minitube精子视觉数字精液评估系统 | Minitube Group | 12500/1300 |
| 组织学染色 | Bouin固定液 | -- | -- |
| 电子显微镜 | JEM-1400透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 扫描电子显微镜 | SU8010扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 免疫荧光 | LSM880显微镜 | Zeiss | -- |
| SP8显微镜 | Leica | -- | |
| LSM780显微镜 | Zeiss | -- | |
| LSM880显微镜 | Zeiss | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A-Sepharose | GE | 17-1279-03 |
| 免疫荧光 | PureSperm | Nidacon International | -- |
| 精子活力分析 | 磷酸盐缓冲液 | Gibco | C14190500BT |
| 免疫荧光 | 牛血清白蛋白 | Amresco | AP0027 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | Ccdc113基因敲除策略（CRISPR/Cas9，靶向外显子2-6，缺失10215 bp，插入64 bp） 阅读提示：Materials and methods: Animals |
| 蛋白相互作用 | HEK293T细胞转染条件（质粒类型，如GFP-CCDC113、FLAG-CFAP57等） 阅读提示：Materials and methods: Immunoprecipitation |
| 精子形态分析 | 精子固定和染色条件（4% PFA，5 min，室温） 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence staining |
| 透射电镜 | 固定条件（2.5%戊二醛，4°C过夜），包埋和染色方法 阅读提示：Materials and methods: Electron microscopy analysis |
| 免疫荧光定位 | 抗体稀释比例（如anti-CCDC113 1:25，anti-α/β-tubulin 1:100） 阅读提示：Materials and methods: Antibodies |