捐献者临床数据收集和肾活检标本获取
收集健康日本活体肾捐献者的临床信息并获取肾组织标本,用于估计肾单位数量和足细胞计量学参数。
从医院归档的2007年至2017年间活体肾捐献者中获取活检标本,使用18号针头在肾切除时及再灌注后1小时获取,本研究使用1小时标本。
Podometrics in Japanese Living Donor Kidneys: Associations with Nephron Number, Age, and Hypertension
研究包含两个独立证据层级:人体活检样本的免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析,以及结合增强CT和活检标本的体视学方法估计肾单位数量,并进行了功能验证(年龄相关性丢失)和机制验证(高血压关联)。
日本活体肾捐献者肾脏活检标本 增强CT影像
标本来自30例日本活体肾捐献者,中位年龄57岁 使用18号针头在肾切除时及再灌注后1小时获取活检标本,本研究使用1小时标本 肾小球轮廓数至少8个的纳入标准 免疫染色使用DACH1、WT1、TLE4和synaptopodin抗体 共聚焦显微镜成像参数(×40油浸物镜,NA=1.25)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
收集健康日本活体肾捐献者的临床信息并获取肾组织标本,用于估计肾单位数量和足细胞计量学参数。
从医院归档的2007年至2017年间活体肾捐献者中获取活检标本,使用18号针头在肾切除时及再灌注后1小时获取,本研究使用1小时标本。
标记足细胞核和细胞质,用于识别和计数足细胞。
对肾活检标本进行固定、石蜡包埋、切片(3 μm厚),经脱蜡、再水化、抗原修复(EDTA缓冲液,92°C,2小时)、封闭(1% BSA,1小时)后,与一抗(DACH1、WT1、TLE4、synaptopodin)4°C孵育过夜,再与荧光二抗孵育,并使用含DAPI的淬灭试剂盒显示细胞核。
获取肾小球图像并分析足细胞核和细胞质,用于计算足细胞密度和数量。
使用Leica SP5激光共聚焦显微镜采集图像,使用Fiji软件分析图像,界定肾小球丛面积,识别DACH1阳性的足细胞核,测量核的直径,并基于SNP染色创建二值图像以测量细胞质面积。
估计非硬化和总肾小球数量,用于计算总足细胞数和足细胞丢失率。
使用增强CT图像测量肾皮质体积,乘以肾小球密度(基于活检标本的体视学方法)估计肾小球数量。
检验足细胞计量学参数与年龄、高血压之间的关联,并估计年丢失率。
使用非参数检验(Mann-Whitney U检验、卡方检验、Spearman相关性检验)和多元线性回归分析,估计线性回归斜率以计算年下降速率。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光染色 | DACH1抗体 | Proteintech | 10914-1-AP |
| WT1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7385 | |
| TLE4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-365406 | |
| Synaptopodin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-515842 | |
| Alexa Fluor 568标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | Invitrogen | A11004 | |
| Alexa Fluor 633标记的山羊抗兔IgG抗体 | Invitrogen | A21070 | |
| 含DAPI的自身荧光淬灭试剂盒 | Vector Laboratories | SP-8500 | |
| 共聚焦成像 | Leica SP5激光共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| 图像分析 | Fiji软件 | -- | -- |
| 统计分析 | SPSS软件版本23 | IBM Inc. | -- |
| GraphPad PRISM 8 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 标本获取 | 活检标本获取时间点(肾切除时或再灌注后1小时)、针头型号(18号) 阅读提示:Methods: Living-Kidney Donors and Clinical Data Collection |
| 纳入标准 | 用于足细胞计量学的单张组织切片中肾小球轮廓数≥8个 阅读提示:Methods: Living-Kidney Donors and Clinical Data Collection |
| 免疫荧光染色 | 一抗稀释倍数(DACH1 1:1000, WT1 1:150, TLE4 1:250, SNP 1:500)、抗原修复条件(EDTA缓冲液,92°C,2小时)、二抗稀释倍数(1:1000) 阅读提示:Methods: Immunofluorescence for Podocyte Markers |
| 共聚焦成像 | 物镜(×40油浸,NA=1.25)、变焦(×1.6)、激光功率恒定 阅读提示:Methods: Confocal Imaging |
| 肾单位数量估计 | 增强CT扫描时机(动脉期)、用于计数的肾小球密度、校正因子(1.43和1.268) 阅读提示:Methods: Estimation of Nephron Number |