日本活体捐献肾脏的足细胞计量学:与肾单位数量、年龄和高血压的关联

Podometrics in Japanese Living Donor Kidneys: Associations with Nephron Number, Age, and Hypertension

作者信息Kotaro Haruhara, Takaya Sasaki, Natasha de Zoysa, Yusuke Okabayashi, Go Kanzaki, Izumi Yamamoto, Ian S Harper, Victor G Puelles, Akira Shimizu, Luise A Cullen-McEwen, Nobuo Tsuboi, Takashi Yokoo, John F Bertram
PMID33627345
发布时间2021-05-03
DOI10.1681/ASN.2020101486

实验完整度

研究包含两个独立证据层级:人体活检样本的免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析,以及结合增强CT和活检标本的体视学方法估计肾单位数量,并进行了功能验证(年龄相关性丢失)和机制验证(高血压关联)。

主要模型

日本活体肾捐献者肾脏活检标本 增强CT影像

重点核对

标本来自30例日本活体肾捐献者,中位年龄57岁 使用18号针头在肾切除时及再灌注后1小时获取活检标本,本研究使用1小时标本 肾小球轮廓数至少8个的纳入标准 免疫染色使用DACH1、WT1、TLE4和synaptopodin抗体 共聚焦显微镜成像参数(×40油浸物镜,NA=1.25)

摘要

背景:足细胞耗竭、肾单位数量减少、衰老和高血压与肾小球硬化和慢性肾脏病相关。然而,足细胞计量学与肾单位数量之间的关系此前尚未被研究。方法:为研究健康日本人群(该人群肾单位数量相对较少)的足细胞计量学和肾单位数量,我们用足细胞特异性标志物对30例日本活体肾捐献者(中位年龄57岁)的单个石蜡切片进行免疫染色,并用共聚焦显微镜获取图像进行分析。我们使用基于模型的体视学方法估计足细胞计量学,并使用增强计算机断层扫描/活检标本联合体视学方法估计肾单位数量。结果:每个肾脏非硬化肾单位的中位数为659,000(四分位距[IQR],564,000-825,000)。每个肾小球足细胞中位数和足细胞密度分别为518(IQR,428-601)个/丛和219(IQR,180-253)个/10^6μm^3;这些值与其他种族先前报道的值相似。每个肾脏的总足细胞数(通过将个体非硬化肾小球数乘以每个肾小球的足细胞数获得)为3.76亿(IQR,2.59亿-4.49亿),供者间差异达7.4倍。平均而言,这些健康肾脏每年每个肾脏丢失563万个足细胞,其中大部分丢失与全球性肾小球硬化导致的肾小球丢失相关,而非健康肾小球中的足细胞丢失。高血压与较低的足细胞密度和较大的足细胞体积相关,且独立于年龄。结论:对个体肾脏中肾单位、足细胞及其他足细胞计量学参数的估计,为这些参数与年龄和高血压之间的关系提供了新的见解。该方法在评估健康和疾病状态下的肾脏方面可能具有重要价值。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
健康日本个体(肾单位数量相对较低)的足细胞计量学参数是否与其他种族相似,以及这些参数与年龄和高血压的关联如何?
核心机制
足细胞耗竭(绝对或相对)和代偿性足细胞肥大是肾小球硬化的早期事件;年龄相关的足细胞丢失主要与肾小球硬化导致的肾小球丢失相关,而非健康肾小球中的足细胞丢失。
主要证据
对30例日本活体肾捐献者的肾脏活检标本进行免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析,估计足细胞密度和数量;结合增强CT和活检标本的体视学方法估计肾单位数量;使用线性回归分析年龄与足细胞丢失速率的关系,并比较不同种族间的足细胞参数。
研究意义
首次在同一健康人体肾脏中同时估计足细胞计量学参数和肾单位数量,显示总足细胞数存在广泛变异性,并提示高血压相关足细胞变化发生在明显肾脏疾病之前,该方法可能有助于评估健康和疾病状态下的肾脏。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

捐献者临床数据收集和肾活检标本获取

收集健康日本活体肾捐献者的临床信息并获取肾组织标本,用于估计肾单位数量和足细胞计量学参数。

从医院归档的2007年至2017年间活体肾捐献者中获取活检标本,使用18号针头在肾切除时及再灌注后1小时获取,本研究使用1小时标本。

2

免疫荧光染色标记足细胞标志物

标记足细胞核和细胞质,用于识别和计数足细胞。

对肾活检标本进行固定、石蜡包埋、切片(3 μm厚),经脱蜡、再水化、抗原修复(EDTA缓冲液,92°C,2小时)、封闭(1% BSA,1小时)后,与一抗(DACH1、WT1、TLE4、synaptopodin)4°C孵育过夜,再与荧光二抗孵育,并使用含DAPI的淬灭试剂盒显示细胞核。

3

共聚焦显微镜成像和图像分析

获取肾小球图像并分析足细胞核和细胞质,用于计算足细胞密度和数量。

使用Leica SP5激光共聚焦显微镜采集图像,使用Fiji软件分析图像,界定肾小球丛面积,识别DACH1阳性的足细胞核,测量核的直径,并基于SNP染色创建二值图像以测量细胞质面积。

4

肾单位数量估计

估计非硬化和总肾小球数量,用于计算总足细胞数和足细胞丢失率。

使用增强CT图像测量肾皮质体积,乘以肾小球密度(基于活检标本的体视学方法)估计肾小球数量。

5

统计分析

检验足细胞计量学参数与年龄、高血压之间的关联,并估计年丢失率。

使用非参数检验(Mann-Whitney U检验、卡方检验、Spearman相关性检验)和多元线性回归分析,估计线性回归斜率以计算年下降速率。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DACH1抗体Proteintech10914-1-AP
WT1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-7385
TLE4抗体Santa Cruz BiotechnologySC-365406
Synaptopodin抗体Santa Cruz BiotechnologySC-515842
Alexa Fluor 568标记的山羊抗小鼠IgG抗体InvitrogenA11004
Alexa Fluor 633标记的山羊抗兔IgG抗体InvitrogenA21070
含DAPI的自身荧光淬灭试剂盒Vector LaboratoriesSP-8500
Leica SP5激光共聚焦显微镜Leica Microsystems--
Fiji软件----
SPSS软件版本23IBM Inc.--
GraphPad PRISM 8GraphPad Software--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
标本获取
活检标本获取时间点(肾切除时或再灌注后1小时)、针头型号(18号)
阅读提示:Methods: Living-Kidney Donors and Clinical Data Collection
纳入标准
用于足细胞计量学的单张组织切片中肾小球轮廓数≥8个
阅读提示:Methods: Living-Kidney Donors and Clinical Data Collection
免疫荧光染色
一抗稀释倍数(DACH1 1:1000, WT1 1:150, TLE4 1:250, SNP 1:500)、抗原修复条件(EDTA缓冲液,92°C,2小时)、二抗稀释倍数(1:1000)
阅读提示:Methods: Immunofluorescence for Podocyte Markers
共聚焦成像
物镜(×40油浸,NA=1.25)、变焦(×1.6)、激光功率恒定
阅读提示:Methods: Confocal Imaging
肾单位数量估计
增强CT扫描时机(动脉期)、用于计数的肾小球密度、校正因子(1.43和1.268)
阅读提示:Methods: Estimation of Nephron Number