重组EF-Ts蛋白表达与纯化
获得用于后续免疫原性和功能研究的重组滑液支原体EF-Ts蛋白
通过重叠PCR将EF-Ts基因中的TGA密码子突变为TGG，克隆至pET-28a(+)载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，通过Ni-NTA亲和纯化并用8M尿素处理去除共纯化的EF-Tu.Ts复合物，经SDS-PAGE鉴定。
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滑液支原体延伸因子热稳定蛋白是一种通过内吞作用进入细胞并刺激DF-1细胞增殖的黏附相关蛋白
Mycoplasma synoviae elongation factor thermo stable is an adhesion-associated protein that enters cells by endocytosis and stimulates DF-1 cell proliferation.
实验完整度
高包含体外重组蛋白表达纯化、抗体中和抑制实验、ELISA/免疫荧光结合检测、内吞抑制实验、细胞增殖实验等多层级功能与机制验证，且实验设计较为完整。
主要模型
滑液支原体WVU1853株 DF-1鸡胚成纤维细胞系 大肠杆菌BL21(DE3)表达系统 新西兰白兔
重点核对
M. synoviae菌株WVU1853的EF-Ts基因序列需经TGA密码子突变（TGG）以实现大肠杆菌表达 兔抗rEF-Ts血清制备的免疫程序：首免800μg，二至四免400μg，间隔两周后每周一次共四次 rEF-Ts与DF-1细胞膜蛋白结合实验使用0.08–10μg rEF-Ts，孵育2小时 内吞抑制实验使用25μM辛伐他汀和20μM Pitstop-2预处理DF-1细胞30分钟 DF-1细胞增殖实验使用不同浓度rEF-Ts（0–40μg）处理24h、48h或72h
摘要
滑液支原体是一种重要的禽类病原体，可引起鸡和火鸡的呼吸道感染和关节炎症状，给全球家禽养殖业造成重大经济损失。细胞黏附是支原体感染的关键阶段，与此过程相关的蛋白在其发病机制中发挥重要作用。延伸因子热稳定蛋白是原核生物合成中的一个重要因子，作为延伸因子热不稳定蛋白的鸟苷酸交换因子。迄今为止，关于EF-Ts在支原体感染中的作用知之甚少。在本研究中，我们通过液相色谱-串联质谱筛选，将EF-Ts鉴定为滑液支原体中的一种免疫原性蛋白。我们构建了大肠杆菌重组表达载体，并制备了高效兔抗血清。免疫印迹分析和悬浮免疫荧光显示，EF-Ts位于细胞膜和细胞质中。制备的兔EF-Ts抗血清具有补体依赖的支原体杀伤活性，并抑制rEF-Ts和滑液支原体与DF-1细胞的黏附。体外结合实验表明，EF-Ts能以剂量依赖性方式与纤连蛋白和鸡纤溶酶原结合。此外，EF-Ts可通过脂筏和网格蛋白依赖性内吞作用进入细胞，并诱导DF-1细胞增殖。总之，我们的研究表明，滑液支原体EF-Ts是一种潜在的免疫原性新型黏附蛋白，在感染过程中作为滑液支原体黏附宿主细胞的关键毒力因子。这些研究进一步加深了我们对滑液支原体致病机制的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 滑液支原体延伸因子热稳定蛋白（EF-Ts）是否具有免疫原性，并是否作为黏附相关蛋白参与支原体对宿主细胞的黏附、内吞及增殖调控。
- 核心机制
- EF-Ts作为滑液支原体表面多功能膜蛋白，通过与胞外基质组分纤连蛋白和纤溶酶原结合介导黏附，并通过网格蛋白和脂筏依赖性内吞进入DF-1细胞，进而促进细胞增殖。
- 主要证据
- 通过LC-MS/MS鉴定EF-Ts免疫原性，western blot和免疫荧光定位在膜表面，ELISA和免疫荧光验证rEF-Ts与DF-1细胞结合及抗体抑制，内吞共定位和抑制剂实验证明网格蛋白/脂筏途径，CCK-8显示>20μg/ml rEF-Ts促进DF-1增殖。
- 研究意义
- EF-Ts可能作为滑液支原体亚单位疫苗候选靶点，加深对滑液支原体致病机制的理解，为后续疫苗和药物研发提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EF-Ts免疫原性验证
验证EF-Ts能否刺激宿主产生特异性抗体及其在不同菌株中的保守性
用纯化的rEF-Ts免疫新西兰白兔制备多克隆抗血清；通过western blot检测抗血清特异性及EF-Ts在8个临床分离株中的表达；ELISA检测抗体效价。
EF-Ts亚细胞定位分析
确定EF-Ts在滑液支原体中的分布位置
用Triton X-114提取滑液支原体膜和胞质蛋白，通过western blot和ELISA检测EF-Ts分布；用悬浮免疫荧光进一步确认膜表面定位。
补体依赖杀伤实验
评估rEF-Ts抗血清能否通过补体途径杀伤滑液支原体
将滑液支原体与灭活抗血清混合，加入补体，孵育后涂板计数菌落，计算杀菌率。
rEF-Ts与DF-1细胞黏附能力分析
验证rEF-Ts能否与DF-1细胞结合及其特异性
通过ELISA检测不同浓度rEF-Ts与DF-1细胞膜蛋白的结合，并检测抗血清的抑制作用；通过细胞免疫荧光观察rEF-Ts在细胞表面的结合及抗体抑制。
rEF-Ts与纤连蛋白和纤溶酶原结合
探索EF-Ts黏附宿主细胞的分子机制，验证其与细胞外基质蛋白的结合
通过dot blot和ELISA检测不同浓度rEF-Ts与hFn和cPlg的结合。
rEF-Ts内吞途径研究
探究rEF-Ts进入DF-1细胞的介导机制
通过共定位实验观察rEF-Ts与Cav-1和CLTC的共定位；用内吞抑制剂（辛伐他汀、Pitstop-2）处理后，激光共聚焦检测细胞内的荧光信号变化。
rEF-Ts对DF-1细胞增殖的影响
验证rEF-Ts进入细胞后是否影响细胞增殖
用不同浓度rEF-Ts处理DF-1细胞，CCK-8试剂盒检测不同时间点的细胞活力；另将滑液支原体与rEF-Ts共同处理，观察对细胞活力的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
重组蛋白表达与纯化
亚细胞定位分析
细胞增殖检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 支原体培养基基础 | Haibo | -- |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | Roche | -- | |
| L-半胱氨酸 | Solarbio | -- | |
| 猪血清 | Minhai | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 基因克隆 | pET-28a(+)表达载体 | Novagen | -- |
| 基因组提取 | 细菌基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen | -- |
| 蛋白诱导表达 | 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 | Solarbio | -- |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA His标签纯化琼脂糖 | MCE | HY-K0210 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG H&L/FITC二抗 | Bioss | bs-0295G-FITC |
| 蛋白结合 | 山羊抗兔IgG H&L/HRP | Bioss | bs-0295G-HRP |
| 显微镜观察 | Zeiss Observer A1倒置荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| Leica Deltavision Ultra Acquire Ultra显微镜 | Leica | -- | |
| 内吞研究 | Pitstop-2 | MCE | HY-115604 |
| 辛伐他汀 | MCE | HY-17502 | |
| Caveolin-1单克隆抗体 | Proteintech | 66,067-1-Ig | |
| 网格蛋白重链单克隆抗体 | Proteintech | 66,487-1-Ig | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L/Cy3二抗 | Bioss | bs-0296G-Cy3 | |
| 细胞骨架标记 | 肌动蛋白示踪剂Red-555 | Beyotime | -- |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime | -- |
| 补体杀伤 | 补体（冻干补体） | BerseeTech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株与细胞培养 | M. synoviae WVU1853培养条件（培养基成分、血清比例、37°C、5% CO2）；DF-1细胞培养条件（DMEM+10% FBS） 阅读提示：Methods: Bacterial strains, cell lines, plasmids, and cultivation |
| 重组蛋白表达与纯化 | EF-Ts基因TGA密码子突变；IPTG浓度1mM，16°C过夜；Ni-NTA纯化；8M尿素处理去除EF-Tu.Ts复合物 阅读提示：Methods: Cloning, expression, and purification of EF-Ts |
| 抗血清制备 | 新西兰白兔免疫程序：首免800μg，后续400μg，间隔两周后每周一次共4次；血清收集时间 阅读提示：Methods: EF-TS polyclonal antiserum preparation and immunogenicity characterization |
| 补体杀伤实验 | 血清灭活条件（56°C 30min）；血清、菌液、补体比例（60μl/180μl/60μl）；孵育时间1小时；涂板梯度 阅读提示：Methods: Analysis of complement-dependent killing of M. synoviae |
| 黏附实验 | DF-1细胞膜蛋白包被量0.5μg；rEF-Ts浓度0.08-10μg；孵育时间2h；抗体稀释度 阅读提示：Methods: Analysis of EF-Ts binding to DF-1 cells |
| 内吞实验 | rEF-Ts用量20μg；抑制剂浓度（辛伐他汀25μM，Pitstop-2 20μM）；预处理时间30分钟；孵育时间2h 阅读提示：Methods: rEF-Ts endocytosis pathway studies |
| 增殖实验 | DF-1细胞接种密度4×10^3；rEF-Ts浓度范围；处理时间24h、48h、72h；CCK-8孵育时间2h 阅读提示：Methods: Cell Counting Kit-8 (CCK-8) analysis |