正常与隐睾牦牛垂体端粒细胞的形态学鉴定及分布比较

Morphological identification and distribution comparison of telocytes in pituitary gland between normal and cryptorchid yaks.

作者信息Yumei Qi, Ligang Yuan, Jianlin Zeng, Xiaofen Wang, Long Ma, Jinghan Lv
PMID39394144
发布时间2024-10-11
DOI10.1186/s12917-024-04307-1

实验完整度

包含形态学(TEM、HE、甲苯胺蓝)、免疫荧光和分子检测(qRT-PCR、Western blot)三个层面,但缺乏功能验证或机制验证。

主要模型

正常牦牛垂体组织 隐睾牦牛垂体组织

重点核对

垂体组织样本来源:正常牦牛3例,隐睾牦牛3例,取自青海省西宁市指定屠宰场 TEM样本固定:2.5%戊二醛固定,2%锇酸后固定,梯度丙酮脱水,环氧树脂包埋 免疫荧光抗体稀释比例:CD34 1:300,Vimentin 1:300,CD117 1:350,α-SMA 1:300 qRT-PCR内参基因:β-actin,使用2−ΔΔCT法计算相对表达量 Western blot抗体稀释比例:CD34、CD117、Vimentin、α-SMA均为1:500,β-actin为1:3000

摘要

背景:端粒细胞(TCs)是许多哺乳动物器官中的一种新型间质细胞,参与组织代谢、机械支持、免疫调节等方面。本研究旨在探讨牦牛垂体中TCs的组织化学特征及其在隐睾牦牛中的变化。方法:透射电子显微镜(TEM)、甲苯胺蓝染色、免疫荧光、qRT-PCR和Western blotting可能有助于我们了解TCs的分布特征和生物学功能。结果:TEM证实垂体中存在TCs,具有小胞体和念珠状端足(Tps)。Tps从胞体延伸至血窦周围血管间隙,其数量与细胞核的形态密切相关。隐睾牦牛垂体中TCs最明显的变化是Tps相对较短,分泌囊泡减少。H.E.和甲苯胺蓝染色显示,TCs不仅分布在窦状血管和腺细胞团之间,还出现在血管内皮细胞表面。通过免疫荧光评估TCs生物标志物如Vimentin/CD34、CD117/CD34和α-SMA/CD34的共表达,以进一步确定TCs的表型特征。此外,我们分析了这些生物标志物的mRNA和蛋白表达,以确定TCs变化的特征和可能的生物学作用。隐睾牦牛垂体中CD117的mRNA和蛋白表达均显著高于正常组(p<0.01),隐睾牦牛中CD34的蛋白表达显著高于正常组(p<0.01)。Vimentin和α-SMA的mRNA表达无显著差异(p>0.05),而正常牦牛中的蛋白表达显著增加(p<0.05)。结论:总之,本研究首次报道了牦牛垂体中TCs的生物学特征。虽然分布特征没有显著变化,但隐睾牦牛中TCs的生物学特征变化明显,表明TCs参与了垂体局部微环境的改变。因此,我们的研究为进一步研究TCs在牦牛隐睾发生过程中在垂体中的作用提供了线索。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探讨牦牛垂体中端粒细胞(TCs)的组织化学特征及其在隐睾牦牛中的变化。
核心机制
文中未明确说明
主要证据
通过TEM、光镜和免疫荧光观察TCs的分布与形态,并检测标志物CD34、CD117、Vimentin和α-SMA的mRNA和蛋白表达。发现隐睾牦牛垂体中CD117和CD34表达显著升高,Vimentin和α-SMA蛋白表达显著降低。
研究意义
本研究首次报道了牦牛垂体中TCs的生物学特征,为研究TCs在牦牛隐睾发生过程中的作用提供了线索,并提示TCs可能作为隐睾症和其他生殖疾病的新型治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物样本采集与处理

获取正常和隐睾牦牛的垂体组织,用于后续形态学和分子检测。

从青海省西宁市指定屠宰场收集正常牦牛和隐睾牦牛的垂体样本各3例,部分液氮速冻保存用于RNA和蛋白提取,其余分别置于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中用于组织学和超微结构研究。

2

透射电镜观察

观察TCs的超微结构特征,包括细胞体、端足和分泌囊泡。

垂体组织经戊二醛固定、锇酸后固定、梯度丙酮脱水、环氧树脂包埋后制备超薄切片,经醋酸铀和柠檬酸铅染色,使用JEM-100CX电子显微镜观察。

3

光学显微镜观察(H.E.和甲苯胺蓝染色)

观察TCs在垂体组织中的分布位置和形态特征。

新鲜垂体组织经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片,分别进行H.E.和甲苯胺蓝染色,使用Olympus DP73显微镜拍照。

4

免疫荧光双标

检测TCs标志物CD34/CD117、CD34/Vimentin、CD34/α-SMA的共表达,确定TCs的表型特征。

石蜡切片脱蜡后,经柠檬酸钠缓冲液抗原修复、H2O2阻断内源性过氧化物酶、封闭液封闭,与一抗4℃孵育过夜,洗后与荧光二抗37℃孵育1小时,DAPI染核,封片后使用DP73显微镜拍照。

5

qRT-PCR检测mRNA表达

检测CD34、CD117、Vimentin和α-SMA的mRNA表达水平,比较正常与隐睾牦牛垂体中的差异。

使用TRIzol提取垂体组织总RNA,反转录合成cDNA,利用SYBR Green II进行qRT-PCR,以β-actin为内参,采用2−ΔΔCT法计算相对表达量。

6

Western blot检测蛋白表达

检测CD34、CD117、Vimentin和α-SMA的蛋白表达水平,比较正常与隐睾牦牛垂体中的差异。

垂体组织用RIPA裂解液提取蛋白,经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后,与一抗孵育,再与HRP标记二抗孵育,ECL发光检测,使用Amersham Imager 600成像,ImageJ软件定量。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
小鼠单克隆抗体CD34Beijing BIOSS Antibodies Co., Ltdbsm-41196 M
兔多克隆抗体VimentinBeijing BIOSS Antibodies Co., Ltdbs-8533R
CD117抗体Beijing BIOSS Antibodies Co., Ltdbs-1005R
β-肌动蛋白抗体Beijing BIOSS Antibodies Co., Ltdbs-0061R
α-平滑肌肌动蛋白抗体Affinity BiosciencesAF1032
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG H&LWuhan Proteintech Biotechnology Co., LtdSA00001-2
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG H&LWuhan Proteintech Biotechnology Co., LtdSA00001-1
山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150115
山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
ECL Plus超敏发光液Solebao Biotechnology Co., LtdPE0010
JEM-100CX电子显微镜Japan NEC--
Leica RM2235超薄切片机Leica--
奥林巴斯光学显微镜 (DP73)OlympusDP73
TRIzol试剂Solarbio--
Prime Script RT试剂盒(含gDNA eraser)TransGen Biotech--
2×SYBR Green II PCR预混液TransGen Biotech--
Light Cycler 480热循环仪Roche--
RIPA裂解液Solarbio--
4×上样缓冲液Solarbio--
PVDF膜Millipore--
Tris缓冲盐溶液(含Tween 20)Solarbio--
Amersham Imager 600成像仪General Electric Company--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物样本采集
样本来源:正常牦牛3例,隐睾牦牛3例,采集地点为青海省西宁市指定屠宰场;隐睾判定标准:睾丸未下降至阴囊。
阅读提示:Materials and methods: Animals and sample acquisition
TEM观察
固定:2.5%戊二醛;后固定:2%锇酸4℃3小时;脱水:梯度丙酮(30%-100%);包埋:环氧树脂;染色:醋酸铀和柠檬酸铅。
阅读提示:Materials and methods: TEM
光学显微镜观察
固定:4%多聚甲醛;切片厚度:4 μm;染色:H.E.和甲苯胺蓝。
阅读提示:Materials and methods: Optical microscope
免疫荧光
一抗稀释比例:CD34 1:300,Vimentin 1:300,CD117 1:350,α-SMA 1:300;二抗:AF647 (1:800)和AF488 (1:800);孵育时间:一抗4℃过夜,二抗37℃1小时。
阅读提示:Materials and methods: Immunofluorescence
qRT-PCR
反应体系:20 μL,内含cDNA 1 μL,正反向引物各1 μL,2×SYBR Green II 10 μL,ROX 0.4 μL,无核酸酶H2O 6.6 μL;循环条件:95℃ 30秒,然后95℃ 5秒、60℃ 30秒共45个循环;内参基因:β-actin。
阅读提示:Materials and methods: Real-time quantitative polymerase chain reaction
Western blot
一抗稀释:CD34、CD117、Vimentin、α-SMA均为1:500,β-actin为1:3000;二抗稀释:1:4000。
阅读提示:Materials and methods: Western blot