动物样本采集与处理
获取正常和隐睾牦牛的垂体组织,用于后续形态学和分子检测。
从青海省西宁市指定屠宰场收集正常牦牛和隐睾牦牛的垂体样本各3例,部分液氮速冻保存用于RNA和蛋白提取,其余分别置于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中用于组织学和超微结构研究。
Morphological identification and distribution comparison of telocytes in pituitary gland between normal and cryptorchid yaks.
包含形态学(TEM、HE、甲苯胺蓝)、免疫荧光和分子检测(qRT-PCR、Western blot)三个层面,但缺乏功能验证或机制验证。
正常牦牛垂体组织 隐睾牦牛垂体组织
垂体组织样本来源:正常牦牛3例,隐睾牦牛3例,取自青海省西宁市指定屠宰场 TEM样本固定:2.5%戊二醛固定,2%锇酸后固定,梯度丙酮脱水,环氧树脂包埋 免疫荧光抗体稀释比例:CD34 1:300,Vimentin 1:300,CD117 1:350,α-SMA 1:300 qRT-PCR内参基因:β-actin,使用2−ΔΔCT法计算相对表达量 Western blot抗体稀释比例:CD34、CD117、Vimentin、α-SMA均为1:500,β-actin为1:3000
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取正常和隐睾牦牛的垂体组织,用于后续形态学和分子检测。
从青海省西宁市指定屠宰场收集正常牦牛和隐睾牦牛的垂体样本各3例,部分液氮速冻保存用于RNA和蛋白提取,其余分别置于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中用于组织学和超微结构研究。
观察TCs的超微结构特征,包括细胞体、端足和分泌囊泡。
垂体组织经戊二醛固定、锇酸后固定、梯度丙酮脱水、环氧树脂包埋后制备超薄切片,经醋酸铀和柠檬酸铅染色,使用JEM-100CX电子显微镜观察。
观察TCs在垂体组织中的分布位置和形态特征。
新鲜垂体组织经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片,分别进行H.E.和甲苯胺蓝染色,使用Olympus DP73显微镜拍照。
检测TCs标志物CD34/CD117、CD34/Vimentin、CD34/α-SMA的共表达,确定TCs的表型特征。
石蜡切片脱蜡后,经柠檬酸钠缓冲液抗原修复、H2O2阻断内源性过氧化物酶、封闭液封闭,与一抗4℃孵育过夜,洗后与荧光二抗37℃孵育1小时,DAPI染核,封片后使用DP73显微镜拍照。
检测CD34、CD117、Vimentin和α-SMA的mRNA表达水平,比较正常与隐睾牦牛垂体中的差异。
使用TRIzol提取垂体组织总RNA,反转录合成cDNA,利用SYBR Green II进行qRT-PCR,以β-actin为内参,采用2−ΔΔCT法计算相对表达量。
检测CD34、CD117、Vimentin和α-SMA的蛋白表达水平,比较正常与隐睾牦牛垂体中的差异。
垂体组织用RIPA裂解液提取蛋白,经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后,与一抗孵育,再与HRP标记二抗孵育,ECL发光检测,使用Amersham Imager 600成像,ImageJ软件定量。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | 小鼠单克隆抗体CD34 | Beijing BIOSS Antibodies Co., Ltd | bsm-41196 M |
| 兔多克隆抗体Vimentin | Beijing BIOSS Antibodies Co., Ltd | bs-8533R | |
| CD117抗体 | Beijing BIOSS Antibodies Co., Ltd | bs-1005R | |
| Western blot | β-肌动蛋白抗体 | Beijing BIOSS Antibodies Co., Ltd | bs-0061R |
| 免疫荧光 | α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Affinity Biosciences | AF1032 |
| Western blot | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG H&L | Wuhan Proteintech Biotechnology Co., Ltd | SA00001-2 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG H&L | Wuhan Proteintech Biotechnology Co., Ltd | SA00001-1 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150115 |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Western blot | ECL Plus超敏发光液 | Solebao Biotechnology Co., Ltd | PE0010 |
| TEM | JEM-100CX电子显微镜 | Japan NEC | -- |
| 光学显微镜 | Leica RM2235超薄切片机 | Leica | -- |
| 奥林巴斯光学显微镜 (DP73) | Olympus | DP73 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Solarbio | -- |
| Prime Script RT试剂盒(含gDNA eraser) | TransGen Biotech | -- | |
| 2×SYBR Green II PCR预混液 | TransGen Biotech | -- | |
| Light Cycler 480热循环仪 | Roche | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 4×上样缓冲液 | Solarbio | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Tris缓冲盐溶液(含Tween 20) | Solarbio | -- | |
| Amersham Imager 600成像仪 | General Electric Company | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物样本采集 | 样本来源:正常牦牛3例,隐睾牦牛3例,采集地点为青海省西宁市指定屠宰场;隐睾判定标准:睾丸未下降至阴囊。 阅读提示:Materials and methods: Animals and sample acquisition |
| TEM观察 | 固定:2.5%戊二醛;后固定:2%锇酸4℃3小时;脱水:梯度丙酮(30%-100%);包埋:环氧树脂;染色:醋酸铀和柠檬酸铅。 阅读提示:Materials and methods: TEM |
| 光学显微镜观察 | 固定:4%多聚甲醛;切片厚度:4 μm;染色:H.E.和甲苯胺蓝。 阅读提示:Materials and methods: Optical microscope |
| 免疫荧光 | 一抗稀释比例:CD34 1:300,Vimentin 1:300,CD117 1:350,α-SMA 1:300;二抗:AF647 (1:800)和AF488 (1:800);孵育时间:一抗4℃过夜,二抗37℃1小时。 阅读提示:Materials and methods: Immunofluorescence |
| qRT-PCR | 反应体系:20 μL,内含cDNA 1 μL,正反向引物各1 μL,2×SYBR Green II 10 μL,ROX 0.4 μL,无核酸酶H2O 6.6 μL;循环条件:95℃ 30秒,然后95℃ 5秒、60℃ 30秒共45个循环;内参基因:β-actin。 阅读提示:Materials and methods: Real-time quantitative polymerase chain reaction |
| Western blot | 一抗稀释:CD34、CD117、Vimentin、α-SMA均为1:500,β-actin为1:3000;二抗稀释:1:4000。 阅读提示:Materials and methods: Western blot |