评估VDR对PRV增殖的影响
确定VDR在PRV感染中的功能角色。
在PK-15细胞中通过shRNA敲低VDR或过表达VDR-EGFP，然后感染PRV-QXX，测定病毒滴度（PFU）。
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维生素D受体对伪狂犬病病毒复制至关重要
The vitamin D receptor is essential for the replication of pseudorabies virus.
实验完整度
高包含细胞模型（PK-15、3D4/21）和动物模型（小鼠）多层级验证，并进行了机制验证（p53、Ca2+、PI3K/AKT/mTORC1、AMPK/mTORC1、脂质合成）及功能验证（敲低和过表达）。
主要模型
PK-15细胞（猪肾上皮细胞系） 3D4/21细胞（猪肺泡巨噬细胞系） C57BL/6J小鼠（野生型和p53敲除） HEK293T细胞（用于慢病毒包装）
重点核对
VDR敲低（shVDR-1/2/3）和过表达（VDR-EGFP）对PRV增殖的影响（MOI=0.1和1） PRV感染后VDR和CYP27B1 mRNA及蛋白水平的时间变化（0-48小时） p53抑制剂Pifithrin-β（10 µM）对VDR表达和PRV增殖的影响 p53-/-小鼠与p53+/+小鼠在PRV感染后VDR和CYP27B1表达差异（感染3天） Ca2+螯合剂BAPTA-AM（10 µM）和CaCl2（10 µM）对PRV增殖的影响
摘要
维生素D受体（VDR）是一种核甾体受体，调节各种生物学功能中基因的表达。然而，VDR在伪狂犬病病毒（PRV）感染中的作用尚未被探索。我们发现VDR对PRV增殖有正向影响，因为敲低VDR会损害PRV增殖，而其过表达则促进增殖。此外，我们观察到PRV感染上调VDR转录以及1,25-二羟基维生素D3（VD3）合成，这依赖于p53的激活。此外，VDR敲低阻碍了PRV诱导的脂质合成，表明VDR参与这一过程。为了解读VDR在PRV感染期间刺激脂质合成的机制，我们进行了RNA测序（RNA-seq），发现Ca2+信号通路中的基因显著富集。Ca2+测量表明VDR促进了Ca2+吸收。此外，PI3K/AKT/mTORC1和AMPK/mTORC1通路在我们的RNA-seq数据中也富集。干扰VDR表达或使用BAPTA-AM螯合Ca2+，显著影响了PI3K/AKT/mTORC1和AMPK/mTORC1通路的激活、脂质合成和PRV增殖。总之，我们的研究表明PRV感染促进VDR表达，从而增强Ca2+吸收并激活PI3K/AKT/mTORC1和AMPK/mTORC1介导的脂质合成。我们的发现为PRV预防策略提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- VDR在伪狂犬病病毒（PRV）感染中扮演何种角色，其机制如何？
- 核心机制
- PRV感染通过激活p53，上调VDR表达，促进Ca2+吸收，进而激活PI3K/AKT/mTORC1和AMPK/mTORC1通路，促进脂质合成，最终促进病毒增殖。
- 主要证据
- 通过VDR敲低和过表达证明了VDR对PRV增殖的正向调控；通过启动子分析和ChIP实验证实p53结合VDR启动子并调节其表达；通过RNA-seq和Ca2+测量显示VDR促进Ca2+吸收；通过Western blot和脂质定量显示PI3K/AKT/mTORC1和AMPK/mTORC1通路激活及脂质合成，并在小鼠模型中验证。
- 研究意义
- 揭示了VDR在PRV感染中的新功能，为PRV防控提供了潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PRV感染对VDR表达的影响
确认PRV感染是否上调VDR表达。
在细胞和动物模型中感染PRV-QXX，检测VDR的mRNA和蛋白水平。
阐明p53介导PRV诱导的VDR表达机制
探究PRV上调VDR表达的分子机制。
通过启动子突变分析和ChIP实验确定p53结合位点，使用pifithrin-β抑制p53，并在p53-/-小鼠中验证。
分析VD3合成及其在VDR介导的PRV感染中的作用
探讨VD3在PRV感染中的作用。
检测CYP27B1表达和VD3水平，通过敲低CYP27B1或补充VD3观察对PRV增殖的影响。
检测VDR介导的Ca2+内流
研究VDR在PRV感染中对胞内Ca2+水平的影响。
通过Fluo-4染色和共聚焦显微镜检测胞内Ca2+，比较scramble和shVDR-2细胞在PRV感染下的变化。
评估Ca2+信号对PRV增殖的影响
确定Ca2+在PRV复制中的必要性。
使用CaCl2或BAPTA-AM处理细胞，测定病毒滴度和蛋白表达。
验证VDR介导的Ca2+在PI3K/AKT/mTORC1和AMPK/mTORC1通路激活中的作用
阐明VDR介导的Ca2+吸收与信号通路的关系。
通过Western blot检测信号通路蛋白磷酸化水平，并使用通路抑制剂/激动剂处理。
分析VDR对PRV诱导的脂质合成的影响
验证VDR在PRV诱导的脂质合成中的作用。
检测总胆固醇（TC）、脂滴形成、SREBP2激活及脂质合成相关酶的表达。
评估VDR对PRV生命周期关键步骤的影响
确定VDR影响PRV增殖的具体阶段。
通过吸附、进入、组装和释放实验评估VDR敲低的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 药物处理 | 1,25-二羟基维生素D3 | MedChemExpress | HY-10002 |
| Pifithrin-β | MedChemExpress | HY-16702A | |
| BAPTA-AM | MedChemExpress | HY-100545 | |
| PF-06409577 | MedChemExpress | HY-103683 | |
| 雷帕霉素 | MedChemExpress | HY-10219 | |
| 油酸 | MedChemExpress | HY-N1446 | |
| ELISA | 1,25-二羟基维生素D3 ELISA试剂盒 | Sangon Biotech | D751006 |
| 染色 | BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 |
| 油红O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Western blot | 抗p53抗体 | Proteintech | 10442-1-AP |
| 抗mTORC1抗体 | Proteintech | 66888-1-Ig | |
| 抗磷酸化mTORC1抗体 | Proteintech | 67778-1-Ig | |
| 抗AKT抗体 | Proteintech | 60203-2-Ig | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗Myc抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| 抗EGFP抗体 | Proteintech | 50430-2-AP | |
| 抗PI3K抗体 | Proteintech | 67071-1-Ig | |
| 抗VDR抗体 | Cell Signaling Technology | 12550 | |
| 抗磷酸化p53抗体 | Cell Signaling Technology | 9284 | |
| 抗磷酸化AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 50081 | |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2532 | |
| 抗磷酸化PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 17366 | |
| 抗ACACA抗体 | Cell Signaling Technology | 3676 | |
| 抗磷酸化ACACA抗体 | Cell Signaling Technology | 11818 | |
| 抗FASN抗体 | Abcam | ab22759 | |
| 抗CYP27B1抗体 | Abcam | ab206655 | |
| 抗HMGCR抗体 | Sigma-Aldrich | MABS1233 | |
| 抗磷酸化HMGCR抗体 | Bioss | bs-4063R | |
| 抗PRV VP16抗体 | -- | -- | |
| 抗PRV UL35抗血清 | -- | -- | |
| 抗PRV gB抗体 | -- | -- | |
| 转染 | TurboFect转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | R0531 |
| 细胞活力检测 | CCK-8溶液 | Biodragon | BDXB0002 |
| ChIP实验 | 蛋白酶抑制剂混合物 | MedChemExpress | HY-K0010 |
| IgG | Proteintech | B900620 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | TaKaRa | 9108 |
| TruSeq链式总RNA文库制备试剂盒 | Illumina | RS-122-2503 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| Western blot显色 | Luminata Crescendo Western HRP底物 | Millipore | WBLUR0500 |
| Western blot成像 | GE AI600成像系统 | GE | -- |
| qRT-PCR | PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | RR047A |
| SYBR Premix Ex Taq | TaKaRa | RR820A | |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | -- | -- |
| FluorSave封片剂 | Millipore | 345789 | |
| Zeiss LSM 800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Ca2+测量 | Fluo-4钙离子检测试剂盒 | Beyotime | S1061S |
| 脂质定量 | 胆固醇检测试剂盒 | Solarbio | BC1985 |
| 质粒构建 | pGL3-Basic载体 | Promega | E1751 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和病毒感染 | 细胞系（PK-15、3D4/21、HEK293T）和培养基成分；PRV-QXX病毒株；感染MOI和时间点（MOI=0.1, 1等） 阅读提示：见Materials and Methods中的'Cells and viruses'部分及图1、2、3等图注。 |
| VDR敲低和过表达 | shRNA序列（shVDR-1/2/3）和质粒浓度；转染试剂及步骤；嘌呤霉素筛选浓度和时间 阅读提示：见Materials and Methods中的'Cells and viruses'和'Plasmid construction and transfection'部分。 |
| p53抑制和敲除 | Pifithrin-β浓度（10 µM）和处理时间；p53+/+和p53-/-小鼠品系和感染剂量（5×10^3 TCID50） 阅读提示：见Materials and Methods中的'Chemicals and antibodies'和'Mice'部分，以及图2和图3图注。 |
| VD3处理和CYP27B1敲低 | VD3浓度范围（0-1000 nM）和处理时间；CYP27B1 shRNA序列（shCYP27B1-1/2/3） 阅读提示：见Materials and Methods中的'Cells and viruses'部分和图3图注。 |
| Ca2+检测和干预 | Fluo-4染料浓度和孵育时间；BAPTA-AM和CaCl2浓度（10 µM）及处理时间 阅读提示：见Materials and Methods中的'Ca2+ measurements'部分和图4。 |
| 通路抑制剂和激动剂处理 | Rapamycin（10 µM）、Dorsomorphin（100 nM）、PF-06409577（10 µM）的处理时间 阅读提示：见Materials and Methods中的'Chemicals and antibodies'部分和图5。 |
| 脂质检测 | 胆固醇测定试剂盒和油红O染色的具体步骤；脂质合成相关蛋白的检测 阅读提示：见Materials and Methods中的'Lipid quantification'部分和图6。 |
| 病毒生命周期检测 | 吸附和进入实验的温度和时间（4°C 2小时，37°C 10分钟）；用于去除未进入病毒的胰酶浓度（1 mg/mL） 阅读提示：见Materials and Methods中的'Viral attachment and entry'相关部分（未在文本中明确，但可参考图7）。 |