建立MCAO模型并评估脑缺血
建立脑缺血模型，确认缺血损伤。
对雄性SD大鼠进行右侧大脑中动脉闭塞60分钟，随后再灌注。通过TTC染色评估梗死体积，并测量生理参数。
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脑缺血后的肝细胞激活和肝损伤促进HMGB1介导的肝细胞铁调素上调及全身铁水平调节
Hepatocyte activation and liver injury following cerebral ischemia promote HMGB1-mediated hepcidin upregulation in hepatocytes and regulation of systemic iron levels.
实验完整度
高包含体内MCAO模型、体外AML12细胞实验、多种检测（铁含量、铁调素、HMGB1亚型）及药物干预验证。
主要模型
Sprague-Dawley大鼠MCAO模型 AML12小鼠肝细胞系
重点核对
MCAO模型的建立（60分钟闭塞，再灌注时间点） 肝损伤指标（血清ALT、AST及Eckhoff评分） 肝内铁含量及铁调素表达变化 HMGB1亚型（dsHMGB1）的诱导 体外AML12细胞中HMGB1受体（TLR4、RAGE）介导的铁调素上调
摘要
我们先前报道过高迁移率族蛋白B1（HMGB1），一种损伤相关分子模式（DAMP），通过上调铁调素（一种铁稳态的关键调节因子），增加脑缺血后脑内细胞内铁水平，引发铁死亡。由于肝细胞是产生铁调素和控制全身铁水平的主要细胞，我们研究了脑缺血是否诱导肝细胞中铁调素上调。在啮齿动物模型中，大脑中动脉闭塞（MCAO）后，观察到显著的肝损伤。这种损伤通过Eckhoff评分显著升高以及血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平升高得到证实。此外，肝脏中的总铁水平显著升高，并在肝细胞中检测到细胞内铁积累。肝脏中的铁调素表达主要定位于肝细胞，在MCAO后3小时开始显著增加，并持续快速增加，在24小时达到峰值。有趣的是，MCAO后肝脏中的HMGB1水平也显著升高，其中二硫键形式的HMGB1是主要亚型。使用AML12肝细胞的体外实验表明，重组二硫键HMGB1以Toll样受体4（TLR4）和RAGE依赖的方式显著上调铁调素表达。此外，用ROS清除剂和肽HMGB1拮抗剂治疗揭示，ROS产生和HMGB1诱导均有助于MCAO再灌注后的肝细胞激活和肝损伤。总之，该研究揭示了脑缺血触发肝细胞激活和肝损伤。HMGB1不仅在大脑中，而且在肝脏中强效诱导铁调素，从而影响缺血性卒中后的全身铁稳态。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脑缺血是否诱导肝损伤及肝细胞铁调素上调，并探讨HMGB1在其中的作用。
- 核心机制
- 脑缺血后，肝细胞HMGB1（主要为二硫化物形式）以自分泌/旁分泌方式及血清来源的HMGB1通过TLR4和RAGE信号通路上调肝细胞铁调素表达，进而影响全身铁代谢。
- 主要证据
- MCAO大鼠模型显示肝损伤、肝内铁积累及铁调素上调；AML12细胞实验证明dsHMGB1通过TLR4/RAGE诱导铁调素表达；NAC和HMGB1 A box降低肝ROS和ALT/AST水平。
- 研究意义
- 揭示HMGB1连接脑缺血与全身铁失调的新机制，为卒中相关铁代谢紊乱提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估肝损伤
检测脑缺血后肝脏的组织学和血清学改变。
通过H&E染色和Eckhoff评分评估肝组织损伤，并测量血清ALT和AST水平。
检测肝脏铁积累和铁代谢蛋白表达
确定脑缺血后肝脏铁水平的变化及参与铁调节的蛋白表达。
使用铁测定试剂盒和普鲁士蓝染色评估总铁和细胞内铁，免疫印迹检测FPN、DMT1、Ft-H和Ft-L。
检测肝中铁调素表达
验证脑缺血后肝细胞中铁调素的表达是否上调。
通过ELISA和RT-qPCR检测铁调素蛋白和mRNA水平，并通过免疫组化确认其定位。
检测肝中HMGB1表达及其亚型
探索脑缺血后肝脏中HMGB1表达变化及亚型转换。
免疫印迹检测HMGB1总水平及还原型（reHMGB1）和二硫化物（dsHMGB1）亚型，免疫组化观察细胞定位。
体外验证HMGB1诱导铁调素表达
验证HMGB1亚型是否直接诱导肝细胞铁调素表达及其受体依赖性。
用dsHMGB1、reHMGB1、IL-6处理AML12细胞，并用TLR4、CXCR4、RAGE拮抗剂共处理，检测铁调素mRNA水平。
评估ROS和HMGB1对肝损伤的贡献
测试ROS清除剂和HMGB1拮抗剂是否能减轻肝损伤。
MCAO后1小时给予NAC（ROS清除剂）或HMGB1 A box（拮抗剂），检测肝MDA水平和血清ALT/AST。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 手术 | 尼龙缝线 | AILEE | 4-0 |
| 药物处理 | HMGB1 A盒 | HMGbiotech | HM-012 |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Welgene | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二硫化物HMGB1 | HMGBiotech | HM-120 | |
| 还原型HMGB1 | HMGBiotech | HM-115 | |
| 细胞处理 | TLR4拮抗剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| AMD3100 | Sigma-Aldrich | -- | |
| FPS-ZM1 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 重组IL-6 | R&D Systems | -- | |
| 铁测量 | 铁测定试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 染色 | 核固红溶液 | Abcam | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| TOPreal qPCR 2X预混液SYBR Green（含低ROX） | Enzynomics | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Cusabio | -- |
| 脂质过氧化检测 | 脂质过氧化（MDA）测定试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK085 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 抗FPN抗体 | Abcam | -- | |
| 抗DMT1抗体 | Biorbyt | -- | |
| 抗铁蛋白重链抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗铁蛋白轻链抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗HMGB1抗体 | Abcam | -- | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| HRP标记的二抗 | Merck Millipore | -- | |
| 化学发光试剂盒 | Merck Millipore | -- | |
| 免疫荧光 | 抗CD68抗体（小鼠） | Biorbyt | -- |
| 抗CD68抗体（兔） | Abcam | -- | |
| 抗铁调素抗体 | Bioss Antibodies | -- | |
| 罗丹明标记的抗小鼠IgG | Merck Millipore | -- | |
| FITC标记的抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| VECTASHIELD抗淬灭封片剂（含DAPI） | Vector Laboratories | -- | |
| 免疫组化 | 抗HMGB1抗体（兔） | Novus Biologicals | -- |
| 设备 | I-STAT血气分析仪 | Sensor Devices | -- |
| 脑模具 | ASI | RBM-40000 | |
| 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 光学显微镜（Olympus IX83） | Olympus Corporation | IX83 | |
| 共聚焦显微镜（Zeiss LSM 510 META） | Carl Zeiss Meditec AG | -- | |
| 模型 | Sprague-Dawley大鼠 | -- | -- |
| 细胞系 | AML12细胞 | -- | -- |
| 试剂 | 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MCAO模型建立 | 雄性SD大鼠（250-300g），右侧大脑中动脉闭塞1小时，再灌注时间点 阅读提示：见Materials and Methods中Surgical procedure used for MCAO |
| 肝损伤评估 | 血清ALT、AST水平，Eckhoff评分 阅读提示：见Results和Materials and Methods中Morphometric assessment |
| 铁检测 | 肝脏总铁含量，普鲁士蓝染色 阅读提示：见Materials and Methods中Iron measurement和Perls' Prussian blue staining |
| 铁调素和HMGB1检测 | 肝组织和血清中hepcidin蛋白和mRNA水平，HMGB1蛋白水平及亚型 阅读提示：见Materials and Methods中RT-qPCR、ELISA和Immunoblot analysis |
| 体外实验 | AML12细胞处理浓度和时间，受体拮抗剂处理 阅读提示：见Materials and Methods中Cell culture and treatment |
| 药物干预 | NAC和HMGB1 A box的剂量、给药途径和时间 阅读提示：见Materials and Methods中Drug administration |