大鼠乳腺单细胞多组学分析
揭示不同年龄大鼠乳腺组织的细胞组成和分子变化。
对3、6、12、22月龄F344大鼠乳腺进行scRNA-seq和scATAC-seq测序，鉴定主要细胞类型和亚群，分析年龄相关的差异表达基因和染色质可及性变化。
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Midkine作为年龄相关变化和乳腺肿瘤发生增加的驱动因子
Midkine as a driver of age-related changes and increase in mammary tumorigenesis.
实验完整度
高包含单细胞多组学、组织学、免疫荧光、流式、类器官培养、动物模型等多层级实验，并进行了功能验证和机制研究。
主要模型
Fischer 344大鼠 大鼠乳腺类器官 LA7大鼠乳腺癌细胞系 人乳腺组织样本
重点核对
大鼠品系和年龄：Fischer 344，3、6、12、22月龄 重组midkine蛋白处理剂量：300 μg/kg，腹腔注射，每周3次 NMU诱导肿瘤模型：单次腹腔注射50 mg/kg，处理时间点 类器官培养条件：基质胶、生长因子组合 统计分析：P<0.05为显著性阈值
摘要
衰老是癌症的关键风险因素，但其潜在机制仍不明确。在此，我们通过单细胞多组学技术探究大鼠乳腺的年龄相关变化。我们的发现包括上皮细胞增殖增加、腔上皮特性丧失，以及幼稚B细胞和T细胞随年龄减少。我们发现了一个仅在老年大鼠中存在的腔上皮祖细胞群体，其特征反映了癌前变化，并鉴定出Midkine（Mdk）是一个随年龄上调的基因，且是年龄相关腔上皮祖细胞的调节因子。用Midkine处理年轻大鼠，通过激活PI3K-AKT-SREBF1通路模拟年龄相关变化，并促进Nitroso-N-methylurea诱导的乳腺肿瘤发生。Midkine水平在人血液和乳腺上皮中随年龄增长而增加，且正常乳腺组织中较高的MDK与年轻女性较高的乳腺癌风险相关。我们的发现揭示了衰老与肿瘤发生易感性之间的联系，并确定midkine是年龄依赖性乳腺肿瘤发生增加的介质。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老如何影响正常乳腺组织并增加乳腺癌易感性，以及midkine在其中的作用是什么？
- 核心机制
- Midkine通过激活PI3K-AKT-SREBF1通路促进乳腺上皮细胞增殖，并诱导年龄相关的转录变化。
- 主要证据
- 单细胞多组学发现老年大鼠特有的Aging-LP群体；midkine处理年轻大鼠模拟年龄相关变化；类器官实验显示midkine通过SREBF1发挥促增殖作用；NMU诱导肿瘤模型显示midkine促进肿瘤发生。
- 研究意义
- 研究揭示了衰老与肿瘤起始易感性之间的联系，并确定midkine是年龄依赖性乳腺肿瘤发生增加的介质，可作为乳腺癌风险的生物标志物和预防靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织学与免疫荧光验证
验证年龄相关的组织学变化和蛋白表达变化。
对大鼠乳腺组织进行H&E染色和Ki67、ER、PR、HER2、KRT14、KRT18、MDK、SREBF1等免疫荧光染色，定量分析阳性细胞比例和表达水平。
基于scRNA-seq的细胞轨迹和细胞通讯分析
探究衰老过程中乳腺上皮细胞分化轨迹及细胞间通讯变化。
使用Monocle3进行假时间分析，使用CellChat和NicheNet进行细胞通讯分析，发现MDK是基底层细胞表达并作用于腔上皮祖细胞的重要配体。
Midkine处理年轻大鼠的体内实验
验证midkine是否模拟年龄相关变化。
对3-4周龄年轻大鼠腹腔注射重组midkine蛋白（300 μg/kg，每周3次，持续4周），收集乳腺组织进行组织学、流式和scRNA-seq分析。
类器官培养和抑制剂处理
验证midkine对乳腺上皮增殖的作用及SREBF1的介导作用。
从年轻大鼠分离乳腺类器官，用midkine（300 ng/mL）处理，并联合SREBF1抑制剂（betulin、fatostatin）或mTOR抑制剂（rapamycin）处理5天，测量类器官大小，并通过免疫印迹检测相关蛋白。
NMU诱导乳腺肿瘤发生实验
验证midkine促进乳腺肿瘤起始和进展的作用。
对3-4周龄大鼠给予midkine（300 μg/kg，每周3次）处理，在第14天和第28天腹腔注射NMU（50 mg/kg），监测肿瘤生长，进行生存分析、流式细胞术和bulk RNA-seq分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Advanced DMEM/F-12培养基 | Gibco | -- |
| GlutaMAX补充剂 | Gibco | -- | |
| HEPES缓冲液(1 M, pH 7.4) | Boston BioProducts | 7365-45-9 | |
| 重组人R-Spondin-1 | Peprotech | -- | |
| 两性霉素B | Gibco | 1397-89-3 | |
| B-27补充剂(50X)，无血清 | Gibco | -- | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | 616-91-1 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | 98-92-0 | |
| SB 202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | |
| 重组人KGF(FGF-7) | Peprotech | -- | |
| 重组人FGF-10 | Peprotech | -- | |
| 重组人Heregulinβ-1 | Peprotech | -- | |
| 无动物源重组人EGF | Peprotech | -- | |
| 人重组胰岛素，锌溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DMEM高糖培养基 | Corning | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Corning Matrigel 生长因子减少型基底膜基质，无酚红，无LDEV | Corning | -- | |
| IV型胶原酶 | Worthington Biochemical Corporation | 9001-12-1 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | 37326-33-3 | |
| 药物处理 | N-亚硝基-N-甲基脲 | MedChemExpress | 684-93-5 |
| 白桦脂醇 | MedChemExpress | 473-98-3 | |
| Fatostatin | MedChemExpress | 125256-00-0 | |
| 雷帕霉素 | Selleckchem | 53123-88-9 | |
| A-196 | MedChemExpress | 1982372-88-2 | |
| C70 | Xcess Bio | 1596348-32-1 | |
| 重组大鼠midkine蛋白 | Novus Biologicals | -- | |
| ELISA | 孕酮ELISA试剂盒 | Cayman Chemical | 582601 |
| 催乳素(大鼠) EIA试剂盒 | Cayman Chemical | 589701 | |
| 雌二醇ELISA试剂盒 | Cayman Chemical | 501890 | |
| RT-qPCR | RNeasy微量RNA提取试剂盒 | QIAGEN | 74106 |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | TAKARA | RR037A | |
| TB Green Premix Ex Taq II | TAKARA | RR82WR | |
| 流式分析 | LIVE/DEAD固定化Aqua死细胞染色试剂盒，用于405 nm | Thermo Fisher Scientific | L34966 |
| 单细胞测序 | Chromium Next GEM单细胞5' HT试剂盒v2 | 10x Genomics | 1000356 |
| Chromium Next GEM单细胞ATAC试剂盒v2 | 10x Genomics | 1000406 | |
| Western blot | Clarity Max Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705062 |
| LI-COR Intercept T20 (TBS)抗体稀释液 | LI-COR | 92765001 | |
| 免疫荧光 | VectaShield HardSet抗淬灭封片剂含DAPI | Vector Laboratories | -- |
| Histogel | Epredia | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 大鼠品系为Fischer 344，年龄包括3、6、12、22月龄；年轻大鼠为3-4周龄；midkine处理剂量为300 μg/kg，腹腔注射，每周3次；NMU剂量为50 mg/kg，腹腔单次注射 阅读提示：STAR Methods - Experimental model and study participant details, Rat treatment and tissue harvesting |
| 类器官培养 | 培养基成分包括Advanced DMEM/F12、GlutaMax、HEPES、B27、R-spondin、N-acetylcysteine、Nicotinamide、SB202190、FGF7、FGF10、Heregulinβ-1、EGF；midkine浓度300 ng/mL；抑制剂浓度betulin和fatostatin 5 μM，rapamycin 25 nM；处理时间5天 阅读提示：STAR Methods - Mammary organoid and cell culture, 图5M和5N |
| 免疫表型分析 | 流式抗体panel包括CD45、CD3、CD4、CD8、CD45R、CD161等；需验证抗体克隆和荧光标记 阅读提示：STAR Methods - Flow cytometric analysis, Key Resources Table |