构建表达aCD11c的重组植物乳杆菌菌株
构建能诱导型或组成型表达aCD11c蛋白的植物乳杆菌菌株，用于后续功能验证。
以质粒pSIP409-aCD11c为模板，通过PCR扩增aCD11c片段，分别与载体pSIP409和pLc23连接，构建重组质粒pSIP409-aCD11c'和pLc23-aCD11c，电转化至植物乳杆菌NC8，获得菌株409-a和pLc23-a，并通过Western blot检测aCD11c蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
口服表达aCD11c的植物乳杆菌调节细胞免疫减轻肺炎克雷伯菌感染引起的炎症损伤
Oral administration of Lactobacillus plantarum expressing aCD11c modulates cellular immunity alleviating inflammatory injury due to Klebsiella pneumoniae infection.
实验完整度
高包含体外BMDCs黏附侵袭与活化实验，体内小鼠免疫后T细胞、抗体和黏膜免疫检测，以及KP攻毒后的细菌载量、组织学、Th17/Treg及STAT5/FOXP3通路分析等多层级验证。
主要模型
小鼠骨髓源性树突状细胞（BMDCs） BALB/c小鼠口服免疫模型 肺炎克雷伯菌HRB2020005感染小鼠模型
重点核对
重组植物乳杆菌菌株NC8-pSIP409-aCD11c'和NC8-pLc23-aCD11c的构建及aCD11c蛋白表达验证 BMDCs黏附侵袭实验的MOI=1000和抗CD11c抗体竞争实验 口服免疫剂量109 CFU/100 µL/只，两次免疫（第1-3天和第15-17天） KP攻毒剂量1×10^7 CFU/只，腹腔注射，攻毒后24小时检测细菌载量 Th17和Treg细胞流式检测在攻毒后第3天进行
摘要
背景：肺炎克雷伯菌（KP）是一种人畜共患病原体，可引起急性肺损伤（ALI）和胃肠道炎症，对全球畜牧业构成威胁。然而，目前尚无有效的疫苗来预防KP感染。利用植物乳杆菌（L. plantarum）开发针对KP的黏膜疫苗是一种有效的策略。结果：首先，通过同源重组构建了植物乳杆菌菌株NC8-pSIP409-aCD11c'和NC8-pLc23-aCD11c，分别诱导型或组成型表达aCD11c蛋白。与对照菌株NC8-pSIP409相比，NC8-pSIP409-aCD11c'和NC8-pLc23-aCD11c菌株均能增强植物乳杆菌对骨髓源性树突状细胞（BMDCs）的黏附和侵袭，并在体外刺激BMDCs的活化。用NC8-pSIP409-aCD11c'和NC8-pLc23-aCD11c口服免疫小鼠后，细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫显著改善，表现为脾脏中CD4+ IL-4+ T细胞表达增加，血清中IgG和肠灌洗液（ILF）中分泌型IgA（sIgA）水平升高。此外，通过评估各组织中的细菌载量、肺湿/干重比（W/D）、炎性细胞因子水平和组织学评估，证实了植物乳杆菌对KP感染引起的炎症损伤的保护作用，该保护作用影响了外周血和肺中的Th17和Treg细胞。结论：诱导型和组成型植物乳杆菌菌株NC8-pSIP409-aCD11c'和NC8-pLc23-aCD11c均能刺激细胞和体液免疫水平，并减轻KP感染引起的炎症反应。这些发现为开发针对KP的新型疫苗奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究表达aCD11c的植物乳杆菌（NC8-pSIP409-aCD11c'和NC8-pLc23-aCD11c）能否增强抗肺炎克雷伯菌（KP）感染的免疫保护作用，并阐明其可能的免疫调节机制。
- 核心机制
- aCD11c表达促进植物乳杆菌对树突状细胞的黏附、侵袭和活化，口服免疫后增强细胞、体液和黏膜免疫，并通过激活STAT5/FOXP3信号通路增加Treg细胞、降低Th17细胞，从而减轻KP感染引起的炎症损伤。
- 主要证据
- 体外实验显示aCD11c表达菌株增强BMDCs黏附、侵袭和CD40/CD80表达；体内实验显示免疫小鼠脾脏CD4+IL-4+ T细胞增加，血清IgG和肠灌洗液sIgA升高，KP攻毒后器官细菌载量降低，肺组织W/D比和炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α、TGF-β）降低，肺和外周血中Th17减少、Treg增加，肺组织p-STAT5和FOXP3表达上调。
- 研究意义
- 研究为开发针对KP的新型黏膜疫苗提供了基础，表明植物乳杆菌作为活载体疫苗递送系统具有潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证aCD11c表达菌株对BMDCs的黏附、侵袭和活化能力
评估aCD11c表达是否增强植物乳杆菌对树突状细胞的靶向黏附、侵袭及活化。
将BMDCs与菌株共培养，检测黏附、侵袭率；用流式细胞术检测BMDCs表面CD40和CD80表达。
口服免疫小鼠及免疫反应检测
评估口服重组植物乳杆菌后诱导的细胞、体液和黏膜免疫反应。
BALB/c小鼠分组口服免疫，检测脾脏CD4+ T细胞亚群（IFN-γ、IL-4）、血清IgG和肠灌洗液sIgA水平。
肺炎克雷伯菌攻毒及保护效果评估
评估口服免疫对KP感染的保护作用，包括细菌载量、肺水肿和组织病理学变化。
免疫后第25天腹腔注射KP，攻毒后24小时取肺、肝、脾检测细菌载量，第7天评估肺湿干比和H&E染色。
检测Th17和Treg细胞变化
探究aCD11c表达菌株对KP感染后Th17和Treg细胞平衡的影响。
攻毒后3天，采集外周血和肺组织，通过流式细胞术检测Th17（CD4+IL-17A+）和Treg（CD4+CD25+FOXP3+）细胞比例。
分析STAT5/FOXP3信号通路及炎性细胞因子表达
阐明aCD11c表达菌株调节Treg细胞的分子机制，并评估炎症因子的变化。
Western blot检测肺组织中STAT5、p-STAT5、FOXP3蛋白表达，qRT-PCR检测IL-1β、TNF-α、TGF-β mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养 | MRS培养基 | -- | -- |
| 红霉素 | -- | -- | |
| 质粒构建 | 无缝组装克隆试剂盒 | Clone Smarter Technologies | -- |
| 电转化 | 电穿孔基因导入仪 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白诱导 | SppIP（乳酸菌肽P） | -- | -- |
| Western blot | HA标记一抗 | Beyotime | -- |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Solarbio | -- | |
| 细胞培养 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | -- | |
| 黏附侵袭试验 | 抗小鼠CD11c单克隆抗体 | Bioss | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| 流式分析 | APC标记的抗小鼠CD11c抗体 | BD | -- |
| FITC标记的抗小鼠CD40抗体 | BD | -- | |
| PerCP-Cy5.5标记的抗小鼠CD80抗体 | BD | -- | |
| 同型对照抗体 | BD | -- | |
| FACS Melody流式细胞仪 | BD | -- | |
| FlowJo V10软件 | -- | -- | |
| 免疫 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 脾脏T细胞检测 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 红细胞裂解液 | -- | -- | |
| BD白细胞活化混合物 | BD | -- | |
| BV510标记的抗小鼠CD3e抗体 | BD Pharmingen | -- | |
| BV421标记的抗小鼠CD4抗体 | BD Pharmingen | -- | |
| APC标记的抗小鼠IFN-γ抗体 | BD Pharmingen | -- | |
| PE-Cy7标记的抗小鼠IL-4抗体 | BD Pharmingen | -- | |
| BD固定/破膜试剂盒 | BD | -- | |
| ELISA | sIgA ELISA试剂盒 | MEIMIAN | -- |
| 小鼠IgG细胞因子ELISA试剂盒 | MEIMIAN | -- | |
| Th17/Treg检测 | 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- |
| 胶原酶IV | -- | -- | |
| 胶原酶I | -- | -- | |
| PE标记的抗小鼠IL-17A抗体 | -- | -- | |
| PE标记的抗小鼠CD25抗体 | -- | -- | |
| APC标记的抗小鼠FOXP3抗体 | -- | -- | |
| 组织学检查 | 显微镜 | Leica | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 抗STAT5抗体 | ABclonal | -- | |
| 抗p-STAT5抗体 | ABclonal | -- | |
| 抗FOXP3抗体 | ABclonal | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | ABclonal | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Solarbio | -- | |
| qRT-PCR | RNA提取试剂盒 | Tsingke | -- |
| cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 2×通用SYBR绿qPCR预混液 | ABclonal | -- | |
| 7500实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 6.01软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组菌株构建 | 菌株NC8和质粒pSIP409-aCD11c的来源，培养基和抗生素浓度（红霉素10 µg/mL），电转化参数（2.5 kV, 400 Ω, 25 µF），诱导剂SppIP浓度（50 ng/mL） 阅读提示：Materials and methods: Strains, plasmids, and primers; aCD11c-expressing L. plantarum Construction; Western blotting of aCD11c |
| BMDCs黏附、侵袭和活化实验 | BMDCs来源（C57BL/6小鼠5-6周龄），培养因子浓度（GM-CSF 20 ng/mL, IL-4 10 ng/mL），细胞密度（2×10^5/孔），MOI（1000或10），抗CD11c抗体竞争实验，庆大霉素浓度（500 µg/mL），LPS阳性对照 阅读提示：Materials and methods: Adhesive and invasive ability of recombinant L. plantarum to BMDCs; Activation of BMDCs cells; Figure 3 legends |
| 口服免疫方案 | BALB/c小鼠周龄（6-8周），分组（PBS、KP、409、409-a、pLc23-a），免疫时间和次数（第1-3天和第15-17天），剂量（10^9 CFU/100 µL/只） 阅读提示：Materials and methods: Immunization and challenge; Figure 1A |
| KP攻毒及细菌载量检测 | KP菌株（HRB2020005），攻毒剂量（1×10^7 CFU/只，腹腔注射），攻毒时间（第25天），检测时间（攻毒后24小时），组织（肺、肝、脾） 阅读提示：Materials and methods: Immunization and challenge; Figure 4 legends |
| Th17和Treg细胞检测 | 检测时间（攻毒后3天），外周血和肺单细胞制备方法（消化酶浓度和时间），刺激剂（BD Leukocyte Activation Cocktail）和刺激时间（5小时），抗体组合（CD4、IL-17A、CD25、FOXP3） 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry assays for Th17 and Treg cells after KP infection; Figure 5 legends |
| STAT5/FOXP3通路检测 | 蛋白提取方法（RIPA裂解液含蛋白酶和磷酸酶抑制剂），抗STAT5、p-STAT5、FOXP3、GAPDH抗体来源和稀释度，qRT-PCR引物序列和内参基因（β-actin） 阅读提示：Materials and methods: Analysis of STAT5, p-STAT5, and FOXP3; Quantitative RT-PCR; Figure 7 legends |