建立脑缺血再灌注损伤模型
构建脑I/R损伤的动物模型,以模拟临床缺血性卒中的再灌注损伤。
采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉120分钟后拔栓再灌注,建立MCAO/R模型;假手术组除不插入线栓外,其余操作相同。
Electroacupuncture protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through mitochondrial dynamics.
包含动物模型(MCAO/R)建立、行为学评估、组织学染色、电镜、ELISA、Western blot、免疫荧光等多个独立证据层级,并明确进行功能验证(神经功能、梗死体积)和机制验证(线粒体动力学蛋白表达)。
Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型 大鼠脑皮质神经元
电针穴位:百会(GV20)和大椎(GV14),频率2 Hz/5 Hz,强度1.0 mA,每次20分钟,每天一次,连续7天 假电针:非穴位浅刺(右移5 mm)无电刺激 模型建立:尼龙线栓阻塞大脑中动脉120分钟后拔出再灌注 分组:假手术组、模型组、模型+电针组、模型+假电针组,每组n=15(行为学)或n=5(其他检测) 检测指标:mNSS评分、TTC染色梗死体积、HE染色、电镜线粒体形态、ATP含量和ATP酶活性、Western blot和免疫荧光检测Drp1/Fis1/Mfn1/Mfn2/Opa1
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建脑I/R损伤的动物模型,以模拟临床缺血性卒中的再灌注损伤。
采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉120分钟后拔栓再灌注,建立MCAO/R模型;假手术组除不插入线栓外,其余操作相同。
观察电针是否对脑I/R损伤产生神经保护作用。
在模型+电针组,于术后第一天开始,用不锈钢针插入百会(GV20)和大椎(GV14)穴位,深度3mm,连接电针仪(SDZ-IV),频率2Hz/5Hz,强度1.0mA,每次20分钟,每天一次,连续7天;假电针组在非穴位(右移5mm)浅刺,不接电刺激。
评估电针对神经功能缺损、脑梗死体积和神经元损伤的改善效果。
干预结束后,采用mNSS评分评估神经功能;TTC染色测定脑梗死体积;HE染色观察神经元病理变化。
观察电针对线粒体形态和功能的影响。
透射电镜观察脑皮质神经元线粒体超微结构;ELISA检测ATP含量和ATP酶活性。
验证电针是否调节线粒体分裂与融合相关蛋白的表达。
Western blot检测Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2、Opa1和GAPDH蛋白表达;免疫荧光检测Drp1和Opa1的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 电针干预 | SDZ-IV电针仪 | 华佗 | -- |
| TTC染色 | 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC) | Solarbio | 20220525 |
| HE染色 | 伊红染色液 | ebiogo | B006 |
| 透射电镜 | Leica UC-7超薄切片机 | Leica | UC-7 |
| 柠檬酸铅 | TED PELLA INC | 19 312 | |
| 透射电子显微镜(JEOL JEM1400) | JEOL | JEM1400 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | 碧云天 | P0013B |
| SDS-PAGE凝胶 | Solarbio | S8010 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 抗Drp1抗体 | Proteintech | 12957-1-AP | |
| 抗Fis1抗体 | Bioss | bsm-60551M | |
| 抗Opa1抗体 | Bioss | bs-11764R | |
| 抗Mfn1抗体 | Santa Cruz | SC-166644 | |
| 抗Mfn2抗体 | Santa Cruz | SC-100560 | |
| 抗GAPDH抗体 | Zsbio | TA-08 | |
| ECL试剂盒 | Thermo | 340958 | |
| 免疫荧光 | 抗Drp1抗体 | Thermofish | PA5-105983 |
| 抗Opa1抗体 | Thermofish | MA5-32786 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 图像采集 | 数字切片扫描仪(Pannoramic MIDI) | 3DHISTECH | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 大鼠品系(Sprague-Dawley)、体重(220-250g)、周龄(8周)、麻醉剂量(戊巴比妥钠40mg/kg)、线栓插入长度(约18mm)及阻塞时间(120分钟)、再灌注操作、模型成功标准(Longa评分1-3) 阅读提示:见Methods 2.3 Model establishment |
| 电针干预 | 穴位(GV20、GV14)定位、深度(3mm)、电针仪型号(SDZ-IV)、频率(2Hz/5Hz)、强度(1.0mA)、持续时间(20分钟)、治疗频率(每天1次)及天数(7天)、假电针具体操作(非穴位右移5mm、无电刺激) 阅读提示:见Methods 2.4 EA treatment |
| 神经功能与病理评估 | mNSS评分组成(运动、感觉、平衡、反射)、TTC染色浓度(2%)、孵育时间(20分钟)及温度(37℃)、梗死体积计算公式、HE染色操作细节(染色时间、脱水步骤) 阅读提示:见Methods 2.5, 2.6, 2.7 及 Figure legends 2 |
| 线粒体形态与功能检测 | 电镜固定液(2.5%戊二醛)、固定时间(24h)、脱水浸透条件、切片厚度(70nm)、染色时间(15分钟)、ATP含量和ATP酶活性检测试剂盒及离心条件(3000r/min 5分钟、12000r/min 30分钟) 阅读提示:见Methods 2.8, 2.9 |
| 线粒体动力学蛋白检测 | 蛋白提取(RIPA裂解液)、上样量(20μL)、SDS-PAGE浓度(12%)、一抗稀释比及孵育条件(4℃过夜)、二抗孵育条件(37℃ 1小时)、免疫荧光一抗稀释比及孵育条件、荧光二抗稀释比(1:400)、DAPI染色、图像扫描仪器 阅读提示:见Methods 2.10, 2.11 及 Figure legends 4 |