电针通过线粒体动力学减轻脑缺血再灌注损伤

Electroacupuncture protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through mitochondrial dynamics.

作者信息Cheng-Long Li, Wei Mao, Li-da Zhang, Hai-Sheng Ji, Ting-Ting Tong, Jun-Li Wang, Xiao-Qing Wu, Kui-Wu Li, Hai-Yang Wu, Guo-Qing Zhang, Jun-Yu Zhang, Wei Han, Ying Wang
PMID39148973
期刊Heliyon
发布时间2024-07-19
DOI10.1016/j.heliyon.2024.e34986

实验完整度

包含动物模型(MCAO/R)建立、行为学评估、组织学染色、电镜、ELISA、Western blot、免疫荧光等多个独立证据层级,并明确进行功能验证(神经功能、梗死体积)和机制验证(线粒体动力学蛋白表达)。

主要模型

Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型 大鼠脑皮质神经元

重点核对

电针穴位:百会(GV20)和大椎(GV14),频率2 Hz/5 Hz,强度1.0 mA,每次20分钟,每天一次,连续7天 假电针:非穴位浅刺(右移5 mm)无电刺激 模型建立:尼龙线栓阻塞大脑中动脉120分钟后拔出再灌注 分组:假手术组、模型组、模型+电针组、模型+假电针组,每组n=15(行为学)或n=5(其他检测) 检测指标:mNSS评分、TTC染色梗死体积、HE染色、电镜线粒体形态、ATP含量和ATP酶活性、Western blot和免疫荧光检测Drp1/Fis1/Mfn1/Mfn2/Opa1

摘要

背景:电针(EA)已被证明可促进脑缺血再灌注(I/R)损伤后的功能恢复。然而,线粒体动力学对恢复的贡献仍不清楚。本研究旨在探讨线粒体动力学是否参与电针对脑I/R损伤的作用。方法:通过大脑中动脉闭塞/再灌注建立脑I/R损伤大鼠模型。随后,电针应用于百会(GV20)和大椎(GV14)穴,频率2 Hz/5 Hz,强度1.0 mA,每次20分钟,每天一次,连续七天。通过改良神经功能缺损评分(mNSS)、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色和HE染色评估治疗效果。在透射电子显微镜下观察线粒体形态。通过ELISA测定ATP含量和ATP合酶(ATPases)活性以评估线粒体功能。最后,通过Western blot和免疫荧光染色检测线粒体动力学相关分子,包括动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体 fission 1(Fis1)、线粒体融合素1(Mfn1)、线粒体融合素2(Mfn2)和视神经萎缩1(OPA1)。结果:脑I/R损伤引起神经功能障碍、脑梗死和神经元损伤,电针均能改善。电针改善了线粒体形态和功能。此外,电针改变了线粒体动力学的平衡。具体而言,数据显示Drp1和Fis1的表达显著降低,导致线粒体分裂受到抑制。另外,与线粒体融合相关的Mfn1、Mfn2和Opa1在电针治疗后得到有效促进。然而,假电针在脑I/R损伤大鼠中未显示出任何神经保护作用。结论:总之,我们的研究表明线粒体动力学的平衡对电针治疗脑I/R损伤至关重要。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
电针是否通过调节线粒体动力学来减轻脑缺血再灌注损伤?
核心机制
电针通过抑制Drp1/Fis1介导的线粒体分裂和促进Mfn1/Mfn2/Opa1介导的线粒体融合,平衡线粒体动力学,从而改善线粒体形态和功能,发挥神经保护作用。
主要证据
在MCAO/R大鼠模型中,电针减少神经功能评分、梗死体积和神经元损伤;电镜显示线粒体形态改善;ATP含量和ATP酶活性增加;Western blot和免疫荧光显示电针下调Drp1和Fis1,上调Mfn1、Mfn2和Opa1。
研究意义
为电针治疗脑缺血再灌注损伤提供线粒体动力学新视角,并提示m6A修饰可能成为未来研究方向。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立脑缺血再灌注损伤模型

构建脑I/R损伤的动物模型,以模拟临床缺血性卒中的再灌注损伤。

采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉120分钟后拔栓再灌注,建立MCAO/R模型;假手术组除不插入线栓外,其余操作相同。

2

电针干预

观察电针是否对脑I/R损伤产生神经保护作用。

在模型+电针组,于术后第一天开始,用不锈钢针插入百会(GV20)和大椎(GV14)穴位,深度3mm,连接电针仪(SDZ-IV),频率2Hz/5Hz,强度1.0mA,每次20分钟,每天一次,连续7天;假电针组在非穴位(右移5mm)浅刺,不接电刺激。

3

神经功能与病理评估

评估电针对神经功能缺损、脑梗死体积和神经元损伤的改善效果。

干预结束后,采用mNSS评分评估神经功能;TTC染色测定脑梗死体积;HE染色观察神经元病理变化。

4

线粒体形态与功能检测

观察电针对线粒体形态和功能的影响。

透射电镜观察脑皮质神经元线粒体超微结构;ELISA检测ATP含量和ATP酶活性。

5

线粒体动力学相关蛋白检测

验证电针是否调节线粒体分裂与融合相关蛋白的表达。

Western blot检测Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2、Opa1和GAPDH蛋白表达;免疫荧光检测Drp1和Opa1的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
SDZ-IV电针仪华佗--
2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)Solarbio20220525
伊红染色液ebiogoB006
Leica UC-7超薄切片机LeicaUC-7
柠檬酸铅TED PELLA INC19 312
透射电子显微镜(JEOL JEM1400)JEOLJEM1400
RIPA裂解液碧云天P0013B
SDS-PAGE凝胶SolarbioS8010
PVDF膜MilliporeIPVH00010
抗Drp1抗体Proteintech12957-1-AP
抗Fis1抗体Biossbsm-60551M
抗Opa1抗体Biossbs-11764R
抗Mfn1抗体Santa CruzSC-166644
抗Mfn2抗体Santa CruzSC-100560
抗GAPDH抗体ZsbioTA-08
ECL试剂盒Thermo340958
抗Drp1抗体ThermofishPA5-105983
抗Opa1抗体ThermofishMA5-32786
DAPI----
数字切片扫描仪(Pannoramic MIDI)3DHISTECH--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
大鼠品系(Sprague-Dawley)、体重(220-250g)、周龄(8周)、麻醉剂量(戊巴比妥钠40mg/kg)、线栓插入长度(约18mm)及阻塞时间(120分钟)、再灌注操作、模型成功标准(Longa评分1-3)
阅读提示:见Methods 2.3 Model establishment
电针干预
穴位(GV20、GV14)定位、深度(3mm)、电针仪型号(SDZ-IV)、频率(2Hz/5Hz)、强度(1.0mA)、持续时间(20分钟)、治疗频率(每天1次)及天数(7天)、假电针具体操作(非穴位右移5mm、无电刺激)
阅读提示:见Methods 2.4 EA treatment
神经功能与病理评估
mNSS评分组成(运动、感觉、平衡、反射)、TTC染色浓度(2%)、孵育时间(20分钟)及温度(37℃)、梗死体积计算公式、HE染色操作细节(染色时间、脱水步骤)
阅读提示:见Methods 2.5, 2.6, 2.7 及 Figure legends 2
线粒体形态与功能检测
电镜固定液(2.5%戊二醛)、固定时间(24h)、脱水浸透条件、切片厚度(70nm)、染色时间(15分钟)、ATP含量和ATP酶活性检测试剂盒及离心条件(3000r/min 5分钟、12000r/min 30分钟)
阅读提示:见Methods 2.8, 2.9
线粒体动力学蛋白检测
蛋白提取(RIPA裂解液)、上样量(20μL)、SDS-PAGE浓度(12%)、一抗稀释比及孵育条件(4℃过夜)、二抗孵育条件(37℃ 1小时)、免疫荧光一抗稀释比及孵育条件、荧光二抗稀释比(1:400)、DAPI染色、图像扫描仪器
阅读提示:见Methods 2.10, 2.11 及 Figure legends 4