阿尔茨海默病中与铁死亡相关的基因的鉴定和免疫学特征及实验验证

Identification and immunological characterization of genes associated with ferroptosis in Alzheimer's disease and experimental demonstration.

作者信息Zhen Xiao, Rui Hu, Wan-Lu Liu, Xiao-Xuan He, Ming-You Dong, Zhong-Shi Huang
PMID38963039
发布时间2024-09
DOI10.3892/mmr.2024.13279

实验完整度

中

包含生物信息学分析、细胞实验(SH-SY5Y细胞)和分子验证(RT-qPCR、Western blot),但缺乏动物模型或临床样本验证。

主要模型

SH-SY5Y细胞系(冈田酸处理构建AD模型) GSE33000和GSE28146数据集

重点核对

SH-SY5Y细胞系(Procell,货号PC-H2022072130) 冈田酸浓度25 nM处理48小时 RT-qPCR验证五个FEGs mRNA表达 Western blot验证蛋白表达 Fe2+荧光检测

摘要

阿尔茨海默病(AD)的发病率在全球范围内不断上升,然而由于其复杂的病理生理机制,该病的治疗和预测仍然具有挑战性。因此,本研究旨在分析和表征铁死亡相关基因(FEGs)在AD发病机制中的分子机制,并构建预后模型。研究结果将为AD未来的诊断和治疗提供新的见解。首先,从基因表达综合数据库(GEO)获取AD数据集GSE33000,并从FerrDB获取FEGs。接下来,使用无监督聚类分析获得与AD最相关的FEGs。随后,对FEGs进行富集分析以探索其生物学功能。然后,通过CIBERSORT阐明这些基因在免疫微环境中的作用。之后,通过比较不同机器学习模型的性能选择最优的机器学习模型。为了验证预测效率,使用列线图、校准曲线、决策曲线分析和外部数据集对模型进行了验证。此外,使用逆转录定量PCR和western blot分析验证了不同组间FEGs的表达。在AD中,FEGs表达的改变影响某些免疫细胞的聚集和浸润,这表明AD的发生与免疫浸润密切相关。最后,选择了最合适的机器学习模型,并构建了AD诊断模型和列线图。本研究提供了新的见解,增强了对FEGs在AD中分子机制的理解。此外,本研究提供了可能有助于AD诊断的生物标志物。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
鉴定与AD相关的铁死亡相关基因,并构建诊断模型。
核心机制
铁死亡相关基因表达改变影响免疫细胞浸润,涉及氧化磷酸化和三羧酸循环通路。
主要证据
通过WGCNA和差异表达分析鉴定5个FEGs(GFAP、VIM、MT2A、FAM107A、A4GALT),在AD中上调,并在SH-SY5Y细胞模型中验证。
研究意义
提供可用于AD诊断的生物标志物,为AD诊断和治疗提供新见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

数据收集和差异表达分析

从GEO获取AD相关数据集,筛选差异表达基因。

使用GSE33000数据集,通过limma包鉴定差异表达基因,阈值为|log2FC|>0.3,P<0.05。

2

WGCNA共表达网络构建

识别与AD和铁死亡相关的基因模块。

基于65个FEGs和差异基因构建共表达网络,识别与AD显著相关的模块(棕色模块)。

3

铁死亡相关基因的鉴定和富集分析

筛选与AD相关的FEGs并探索其生物学功能。

通过差异基因和WGCNA模块交叉获得5个FEGs,并进行GO和KEGG富集分析。

4

免疫浸润分析

评估AD中免疫细胞浸润差异及与FEGs的相关性。

使用CIBERSORT分析22种免疫细胞浸润,并计算FEGs与免疫细胞的相关性。

5

机器学习模型构建和验证

构建AD诊断模型并评估其性能。

构建四种机器学习模型(GLM、SVM、RF、XGB),比较AUC选择最优模型,并构建列线图。

6

细胞实验验证

在细胞模型中验证FEGs的表达。

用不同浓度OA处理SH-SY5Y细胞,通过CCK-8确定最适浓度,RT-qPCR和Western blot检测FEGs表达,Fe2+荧光检测。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
SH-SY5Y细胞Procell Life Science & Technology Co., Ltd.PC-H2022072130
冈田酸MedChemExpressHY-N6785
DMEM/F-12培养基Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.--
胎牛血清Sigma-Aldrich; Merck KGaA--
CCK-8试剂盒Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd.C6005M
TRIzol试剂Thermo Fisher Scientific, Inc.--
SureScript第一链cDNA逆转录试剂盒Tolo Biotech Co., Ltd.22107-01
SYBR Green qPCR混合试剂Tolo Biotech Co., Ltd.22208-01
LightCycler 96实时荧光定量PCR仪Roche Diagnostics GmbH--
RIPA组织/细胞裂解液Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.--
无蛋白快速封闭液Shanghai Epizyme Biotech Co.--
抗GAPDH抗体Proteintech Group, Inc.10494-1-AP
抗FAM107A抗体BIOSSbs-6381R
抗GFAP抗体Thermo Fisher Scientific, Inc.53-9892-82
抗VIM抗体Proteintech Group, Inc.10366-1-AP
抗A4GALT抗体BIOSSbs-7588R
HRP偶联二抗Proteintech Group, Inc.SA00001-2
超敏ECL发光液Shanghai Epizyme Biotech Co.SQ201
FerroOrange工作液Dojindo Laboratories, Inc.F374
Microread基因组DNA提取试剂盒Tiangen Biotech Co., Ltd.KG203
Microread 21位点鉴定系统Beijing Microread Genetics Co., Ltd.--
ABI 3730xl遗传分析仪Thermo Fisher Scientific, Inc.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞模型构建
SH-SY5Y细胞来源和基因型验证;冈田酸浓度25 nM,处理时间48小时。
阅读提示:见Methods中'Cell culture and construction of AD models'部分
RNA提取和RT-qPCR
RNA提取方法(TRIzol)、逆转录试剂盒、qPCR引物序列、内参基因GAPDH。
阅读提示:见Methods中'RNA extraction and differential expression...'部分
Western blot
蛋白提取、BCA定量、电泳条件、抗体稀释比例、内参GAPDH。
阅读提示:见Methods中'Protein extraction and western blot validation'部分
Fe2+检测
FerroOrange浓度(1 µmol/l)、孵育时间(30分钟)、激发波长(532 nm)。
阅读提示:见Methods中'Fe2+ fluorescence detection'部分
生物信息学分析
数据来源GSE33000和GSE28146;差异表达阈值;WGCNA参数;机器学习模型选择。
阅读提示:见Methods中'Data collection'和'Construction of machine learning models'部分