风险模型构建
筛选与结直肠癌预后相关的基因并构建风险模型。
利用TCGA和GSE39582数据集，通过单因素Cox回归、Kaplan-Meier分析、LASSO回归和多因素Cox回归构建包含15个基因的风险特征，并计算风险评分。
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锌指蛋白180通过激活METTL14转录活性在结直肠癌中诱导凋亡表型
Zinc finger protein 180 induces an apoptotic phenotype by activating METTL14 transcriptional activity in colorectal cancer.
实验完整度
高包含细胞系体外功能实验、裸鼠移植瘤模型、患者组织样本分析，以及ChIP、荧光素酶等机制验证。
主要模型
HCT116细胞系 RKO细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 SYSU6队列结直肠癌组织样本
重点核对
ZNF180过表达细胞系（HCT116和RKO）的构建及验证 METTL14敲低siRNA序列及转染条件 5-FU处理浓度（0、10、20 µM）和时间（48小时） ChIP实验使用的Flag抗体和METTL14引物 动物实验小鼠分组及细胞注射数量（2×10^6个细胞）
摘要
锌指蛋白180（ZNF180）是一种多功能蛋白质，与核酸相互作用并调节多种细胞过程；然而，ZNF180在结直肠癌（CRC）中的功能仍不清楚。本研究探讨了ZNF180在CRC中的作用和功能，旨在揭示其潜在的分子机制。结果表明，ZNF180在CRC组织中下调，并与CRC患者良好预后相关。此外，ZNF180的表达在CRC中受甲基化调控下调。体内和体外实验表明，ZNF180过表达与抑制细胞增殖和诱导凋亡功能相关。机制上，染色质免疫沉淀-PCR和荧光素酶实验表明，ZNF180通过直接结合并激活甲基转移酶14、N6-腺苷-甲基转移酶非催化亚基（METTL14）的启动子区域，显著调控其转录活性。同时过表达ZNF180和敲低METTL14表明，METTL14的减少可抑制ZNF180对诱导凋亡的作用。临床上，本研究观察到ZNF180和METTL14表达水平之间存在显著正相关，ZNF180和METTL14低表达预示CRC预后不良。总之，这些发现揭示了ZNF180/METTL14轴可能调节CRC凋亡和细胞增殖的新机制。该证据表明，该轴可能作为CRC患者的预后生物标志物和治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨ZNF180在结直肠癌中的表达、功能及其潜在的分子机制。
- 核心机制
- ZNF180作为转录因子直接结合METTL14启动子并激活其转录活性，上调METTL14表达，从而抑制细胞增殖并诱导凋亡。
- 主要证据
- 通过过表达ZNF180的HCT116和RKO细胞系进行体外功能实验，以及裸鼠移植瘤模型体内验证；ChIP和荧光素酶实验证实ZNF180直接结合并激活METTL14启动子；METTL14敲低可逆转ZNF180的凋亡诱导作用。
- 研究意义
- 本研究首次揭示ZNF180/METTL14轴在CRC中的作用，提示该轴可能作为CRC的预后生物标志物和潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ZNF180表达和临床相关性分析
评估ZNF180在结直肠癌组织和细胞系中的表达及其与预后关系。
通过RT-qPCR、western blot和免疫组化检测ZNF180在CRC组织及细胞中的表达，并进行Kaplan-Meier生存分析。
甲基化调控验证
验证ZNF180的表达是否受DNA甲基化调控。
使用5-氮杂胞苷处理HCT116和RKO细胞，检测ZNF180 mRNA和蛋白表达变化。
ZNF180过表达的功能研究
评估ZNF180过表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。
在HCT116和RKO细胞中稳定过表达ZNF180，通过MTS、EdU、Annexin V/PI染色、IF、细胞周期、伤口愈合和Transwell实验检测细胞功能。
体内异种移植瘤模型
验证ZNF180过表达在体内对肿瘤生长的影响。
将ZNF180过表达的HCT116细胞皮下注射入裸鼠，监测肿瘤生长和体重。
机制验证
验证ZNF180是否直接结合并激活METTL14启动子。
通过ChIP实验检测ZNF180与METTL14启动子结合，荧光素酶报告基因实验检测ZNF180对METTL14启动子活性的影响。
功能挽救实验
验证METTL14是否介导ZNF180诱导的凋亡和增殖抑制。
在ZNF180过表达细胞中敲低METTL14，检测凋亡和增殖变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | C11995500BT |
| 胎牛血清 | BIOEXPLORER | BS1614-105 | |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | L3000015 |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | TargetMol Chemicals, Inc. | T19978 |
| siRNA转染 | Opti-MEM培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | 31985070 |
| Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | 13778150 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0039 |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime Institute of Biotechnology | P1009 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白测定试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | P10012S |
| Western blot | PVDF膜 | Beyotime Institute of Biotechnology | FFP39 |
| 脱脂牛奶 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0216 | |
| 化学发光试剂 | Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. | MA0186 | |
| 抗ZNF180抗体 | BIOSS | bs-8485R | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech Group, Inc. | 6004-1-Ig | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech Group, Inc. | 66009-1-Ig | |
| 抗METTL14抗体 | Proteintech Group, Inc. | 26158-1-AP | |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9542S | |
| 抗cleaved-PARP抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 5625S | |
| 抗小鼠二抗 | Cell Signaling Technology, Inc. | 7076 | |
| 抗兔二抗 | Cell Signaling Technology, Inc. | 7074 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 反转录 | cDNA合成试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | R223-01 |
| RT-qPCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | Q711-02 |
| 免疫荧光 | 山羊血清 | Sigma-Aldrich; Merck KGaA | I5256 |
| QuickBlock缓冲液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0256 | |
| ZNF180抗体 | Novus Biologicals, Inc. | NBP1-92613 | |
| METTL14抗体 | Proteintech Group, Inc. | 26158-1-AP | |
| Ki67抗体 | Proteintech Group, Inc. | CL594-27309 | |
| 稀释缓冲液 | Macklin, Inc. | I917953 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)二抗，Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A-11012 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)二抗，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A-11008 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 荧光显微镜IX73 | Olympus Corporation | IX73 | |
| 细胞周期分析 | PI/RNase染色缓冲液 | Beyotime Institute of Biotechnology | C1052 |
| 流式细胞仪CytoFLEX S | Beckman Coulter, Inc. | CytoFLEX | |
| CytoFLEX S | CytExpert 2.4软件 | Beckman Coulter, Inc. | -- |
| 免疫组化 | 柠檬酸盐缓冲液 | Biolegend, Inc. | 420901 |
| 血清封闭液 | OriGene Technologies, Inc. | ZLI-9056 | |
| 稀释缓冲液 | OriGene Technologies, Inc. | ZLI-9030 | |
| 生物素化二抗 | OriGene Technologies, Inc. | PV-9000-1 | |
| 链霉亲和素-酶结合物 | OriGene Technologies, Inc. | PV-9000-2 | |
| 底物-色原混合物 | OriGene Technologies, Inc. | PV-9000-3 | |
| 光学显微镜BX53 | Olympus Corporation | BX53 | |
| H&E染色 | 苏木素染液 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0105S-1 |
| 伊红 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0105S-2 | |
| Permount封片剂 | OriGene Technologies, Inc. | ZLI-9516 | |
| DNA甲基化处理 | 5-氮杂胞苷 | Selleck Chemicals | S1782 |
| EdU染色 | EdU溶液 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0071S |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime Institute of Biotechnology | ST023 | |
| Hoechst 33342 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0071S-6 | |
| 凋亡检测 | Annexin V凋亡检测试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | C1062 |
| 药物处理 | 5-氟尿嘧啶 | Sigma-Aldrich; Merck KGaA | F6627 |
| ChIP实验 | SimpleChIP酶法染色质IP试剂盒 | Cell Signal Technology, Inc. | 9003S |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich; Merck KGaA | F1804 | |
| 正常兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 2729 | |
| 组蛋白H3兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 4620 | |
| 琼脂糖凝胶电泳仪 | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYCP-31CN | |
| 琼脂糖 | Biosharp Life Sciences | BS081 | |
| Gel-green核酸染料 | Beyotime Institute of Biotechnology | D0143 | |
| 细胞增殖 | MTS检测试剂盒 | Promega Corporation | G3580 |
| Transwell实验 | 细胞培养小室 | Corning, Inc. | 3428 |
| 结晶紫 | TargetMol Chemicals, Inc. | T1343L | |
| 荧光素酶实验 | X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Roche; MilliporeSigma | 6366546001 |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega Corporation | E1910 | |
| 细胞培养 | ZNF180过表达质粒(GV341) | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和细胞培养 | 细胞系（HCT116、RKO等）、培养基（DMEM）、FBS浓度（10%）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and methods - Cell lines and cell culture |
| 慢病毒感染 | MOI=10、感染时间12小时、嘌呤霉素筛选浓度（2 mg/ml）及筛选时间（7天） 阅读提示：Materials and methods - Lentiviral production and cell transduction |
| siRNA转染 | siRNA序列（NC、METTL14 si#1和si#2）、siRNA量（60 pmol）、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、处理时间（12小时） 阅读提示：Materials and methods - Small interfering (si)RNA transfection |
| 蛋白表达检测 | 抗体（ZNF180、METTL14等）稀释比（1:1000）、蛋白上样量（20 µg）、PVDF膜规格（0.45 µm） 阅读提示：Materials and methods - Western blotting |
| DNA甲基化处理 | 5-AzaC浓度（10和20 µM）、处理时间（~48小时）、细胞系（HCT116和RKO） 阅读提示：Materials and methods - DNA methylation |
| 细胞凋亡检测 | 5-FU浓度（0、10、20 µM）、处理时间（48小时）、细胞密度（5×10^5）、Annexin V和PI用量（各5 µl） 阅读提示：Materials and methods - Cell apoptosis detection |
| ChIP实验 | Flag抗体（F1804）用于下拉、IgG作为阴性对照、H3作为阳性对照、METTL14引物序列、PCR程序（34个循环） 阅读提示：Materials and methods - Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠）、年龄（4周）、体重（12-14g）、每组样本量（12）、细胞接种量（2×10^6）、注射部位（皮下右胁）、监测频率（每2-4天） 阅读提示：Materials and methods - Animal experiments |
| 荧光素酶实验 | 细胞系（293T）、细胞密度（5000/孔）、转染试剂（X-tremeGENE HP）、METTL14启动子质粒、检测时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods - Luciferase assay |