重组蛋白表达与纯化
获得用于免疫的纯化重组蛋白。
构建了携带His标签的五种重组蛋白（ABC转运蛋白、PBD2、NlpC/P60、酯酶、M23）的表达质粒，在BL21(DE3)细胞中诱导表达，经Ni-NTA亲和层析纯化，并去除内毒素。
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在马驹感染模型中评估针对马红球菌的候选疫苗：细胞和体液免疫反应
Evaluation of vaccine candidates against Rhodococcus equi in BALB/c mice infection model: cellular and humoral immune responses.
实验完整度
高包括体外重组蛋白表达纯化、小鼠免疫、攻毒保护实验、细胞免疫和体液免疫检测以及组织病理学分析等多个独立证据层级。
主要模型
BALB/c小鼠感染模型
重点核对
小鼠品系：6周龄雌性BALB/c小鼠 免疫剂量：100 μg重组蛋白初次免疫，50 μg加强免疫 攻毒剂量：2.34×10^7 CFU/只（腹腔注射） 重组蛋白带有His标签，经BL21(DE3)表达和Ni-NTA纯化 免疫时间：第0、2、4周，攻毒后第1、2、4周检测
摘要
马红球菌是一种人畜共患的机会性病原体，主要导致幼驹和免疫功能低下个体的致命性肺和肺外脓肿。迄今为止，尚无商业化的马红球菌疫苗。我们之前使用反向疫苗学方法从马红球菌的完整基因组中筛选了所有潜在的候选疫苗。其中五个候选疫苗，即ABC转运蛋白底物结合蛋白（ABC转运蛋白）、青霉素结合蛋白2（PBD2）、NlpC/P60家族蛋白（NlpC/P60）、酯酶家族蛋白（酯酶）和M23家族金属肽酶（M23），被选中用于在感染马红球菌的BALB/c小鼠模型中评估其免疫原性和免疫保护效果。结果表明，所有五个候选疫苗免疫的小鼠脾脏中抗原特异性IFN-γ和TNF-α阳性的CD4+和CD8+ T淋巴细胞显著增加，并产生了强大的Th1型和Th2型免疫反应和抗体反应。在马红球菌攻击两周后，与对照组相比，五种候选疫苗的免疫降低了肺部的细菌载量，并改善了肺和肝脏的病理损伤。NlpC/P60、酯酶和M23在诱导针对马红球菌攻击的保护性免疫方面比ABC转运蛋白和PBD2更有效。此外，这些候选疫苗有潜力在小鼠中诱导T淋巴细胞记忆免疫反应。总之，这些抗原是开发针对马红球菌的保护性疫苗的有效候选。马红球菌抗原库已得到扩展，并为开发多价疫苗提供了新思路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估五种马红球菌疫苗候选抗原（ABC转运蛋白、PBD2、NlpC/P60、酯酶、M23）在BALB/c小鼠模型中的免疫原性和免疫保护效果。
- 核心机制
- 这些疫苗候选抗原诱导了Th1和Th2型免疫反应和抗体反应，并增加了脾脏中IFN-γ和TNF-α阳性的CD4+和CD8+ T淋巴细胞，从而提供保护性免疫。
- 主要证据
- 所有五种疫苗候选免疫小鼠均显著增加了脾脏抗原特异性IFN-γ-和TNF-α-阳性CD4+和CD8+ T淋巴细胞，产生了强Th1和Th2免疫反应和抗体反应；攻毒后，五种疫苗均降低了肺部细菌载量，改善了肺和肝脏病理损伤，其中NlpC/P60、酯酶和M23更有效。
- 研究意义
- 这些候选抗原可应用于开发针对马红球菌的疫苗和治疗，扩展了马红球菌抗原库，为多价疫苗开发提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫
评估疫苗候选抗原的免疫原性。
BALB/c小鼠在第0、2、4周皮下注射100 μg（初次）和50 μg（加强）重组蛋白与弗氏佐剂混合，对照组仅注射佐剂。
免疫反应检测
评估疫苗诱导的体液和细胞免疫反应。
最后一次免疫后两周，通过ELISA检测血清抗原特异性IgG1、IgG2a抗体和细胞因子（IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-17A），通过流式细胞术检测脾脏中抗原特异性IFN-γ和TNF-α阳性CD4+和CD8+ T淋巴细胞。
攻毒保护实验
评估疫苗对马红球菌攻击的保护效果。
免疫小鼠腹腔注射亚致死剂量（2.34×10^7 CFU/只）的马红球菌103S，监测体重和采食量，并在攻毒后第1、2、4周检测肺部细菌载量、组织病理学变化以及脾脏T细胞反应。
组织病理学分析
评估疫苗对肺和肝脏病理损伤的保护作用。
攻毒后第2周，收集肺和肝脏，进行宏观和微观病理学检查（H&E染色），评估病变严重程度评分。
记忆T淋巴细胞反应评估
评估疫苗诱导长期记忆T细胞免疫反应的能力。
首次免疫后10周，处死小鼠，取脾脏分离脾细胞，用重组蛋白刺激16小时，通过FCM检测TNF-α和IFN-γ阳性CD4+和CD8+ T淋巴细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白表达 | LB培养基 | -- | -- |
| 卡那霉素 | -- | -- | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| MIKRO220R离心机 | Hettich | -- | |
| JY92-IIN超声破碎仪 | SCIENTZ | -- | |
| 8M尿素缓冲液 | -- | -- | |
| 重组蛋白纯化 | FCL06亲和层析柱 | Beyotime | -- |
| Ni-NTA树脂 | BBI | -- | |
| 二辛可宁酸蛋白测定试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| ToxinEraser™内毒素去除试剂盒 | GenScript | L00338 | |
| 免疫 | 弗氏完全佐剂 | Sigma | F5881 |
| 弗氏不完全佐剂 | Sigma | F5506 | |
| 抗体检测 | 96孔高结合力ELISA板 | Beyotime | FST015 |
| 包被缓冲液 | Solarbio | C1055 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | -- | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgM | Bioss | bs-0368G | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG1 | PhosphoSolutions | MS3211 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG2a | PhosphoSolutions | MS3221 | |
| TMB底物 | Sigma-Aldrich | T0440 | |
| 酶标仪（SynergyHTX） | BioTek Instruments | -- | |
| 流式细胞术 | PerCP标记的抗小鼠CD4抗体 | Biolegend | 100431 |
| FITC标记的抗小鼠CD8a抗体 | Biolegend | 100803 | |
| 流式染色缓冲液 | Rockland | MB-089-0500 | |
| 固定和透化液 | Nordic Mubio | GAS-002M | |
| APC标记的抗小鼠IFN-γ抗体 | Biolegend | 505809 | |
| PE标记的抗小鼠TNF-α抗体 | Biolegend | 506305 | |
| 流式细胞仪（S3e） | Bio-Rad | -- | |
| 细胞因子检测 | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0048c |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3063 | |
| 小鼠IL-4 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0043c | |
| 小鼠IL-17A ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0047c | |
| 细菌载量检测 | 组织研磨器（F6/10） | Jingxin | -- |
| TSA平板 | -- | -- | |
| 组织病理学 | Motic BA210数码显微镜 | Motic | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | 表达条件：BL21(DE3)细胞，30 μg/ml卡那霉素，1.0 mM IPTG诱导5小时；纯化条件：Ni-NTA树脂，600 mM咪唑洗脱；内毒素去除。 阅读提示：Methods: Expression and purification of recombinant antigenic proteins |
| 小鼠免疫 | 小鼠品系和性别：6周龄雌性BALB/c小鼠；免疫剂量：初次100 μg，加强50 μg；免疫途径：背部多点皮下注射；佐剂：弗氏完全佐剂（初次）和弗氏不完全佐剂（加强）；免疫次数：3次，间隔2周。 阅读提示：Methods: Immunization and R. equi 103S challenge procedure; Fig. 2A |
| 攻毒模型 | 攻毒菌株：R. equi 103S，攻毒剂量：2.34×10^7 CFU/只（腹腔注射）；攻毒时间：最后一次免疫后2周。 阅读提示：Methods: Immunization and R. equi 103S challenge procedure; Fig. 3A |
| 免疫反应检测 | ELISA检测抗体滴度（IgG1, IgG2a）和细胞因子（IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-17A）；流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞，脾细胞刺激条件：10 μg/mL重组蛋白刺激16小时，布雷菲德菌素A (10 μg/mL)处理6小时。 阅读提示：Methods: ELISA for serum antibody response; FCM for antigen-specific TNF-α- and IFN-γ-positive T lymphocytes |
| 组织病理学评分 | 肺和肝脏H&E染色切片，评分标准：肺泡隔增宽、纤维渗出、炎性浸润（肺）；肝索结构紊乱、肝细胞变性、炎性浸润（肝），每项0-4分。 阅读提示：Methods: Histopathology; Fig. 4B; Fig. 5B |