哺乳期母体二十二碳六烯酸补充改善离乳子代小鼠运动表现、增强肠道葡萄糖吸收并调节肠道菌群

Maternal docosahexaenoic acid supplementation during lactation improves exercise performance, enhances intestinal glucose absorption and modulates gut microbiota in weaning offspring mice.

作者信息Dalu Lu, Die Yao, Gaoli Hu, Jiefei Zhou, Xiuhua Shen, Linxi Qian
PMID39036494
发布时间2024-07-05
DOI10.3389/fnut.2024.1423576

实验完整度

包含动物模型(小鼠)实验,涉及运动行为测试、肠道形态学、16S rRNA测序、蛋白质组学、葡萄糖吸收试验及分子机制验证(Western blot、qPCR),多个证据层级。

主要模型

离乳子代C57BL/6小鼠 哺乳期母鼠(C57BL/6)

重点核对

母鼠DHA补充剂量:150 mg/(kg·day) 和 450 mg/(kg·day) 补充时间:从GD18至PD21 对照组给予等量载体(0.5% CMC-Na) 每组母鼠数量:n=6;幼鼠样本量因实验而异(n=8-12) 断奶后幼鼠分组:随机分为三组用于不同分析

摘要

摘要 引言 断奶应激引起的肠道功能障碍在母乳喂养期间常见。二十二碳六烯酸(DHA)以促进视觉和大脑发育而闻名,但其对早期肠道发育的影响尚不清楚。本研究探讨了哺乳期母体DHA补充对离乳子代小鼠肠道葡萄糖吸收和肠道菌群的影响。 材料与方法 哺乳期母鼠通过口服给予载体(对照组)、150 mg/(kg体重·天) DHA(L-DHA组)或450 mg/(kg体重·天) DHA(H-DHA组)。断奶后,幼鼠随机分为三组,用于运动分析、微生物和蛋白质组学分析、生化分析、4-脱氧-4-氟-D-葡萄糖(4-FDG)吸收试验以及葡萄糖转运相关蛋白和mTOR信号通路组分的基因表达定量。 结果 与对照组相比,H-DHA组表现出增强的握力和延长的游泳时间。此外,H-DHA组空肠和回肠绒毛高度显著增加,空肠绒毛表面积扩大。微生物分析显示,母体DHA摄入增加了有益肠道细菌的丰度,并促进了与碳水化合物和能量代谢相关的代谢途径。蛋白质组学研究表明,H-DHA组营养转运蛋白丰度增加,吸收和消化相关途径富集。该组空肠和回肠中葡萄糖浓度较高,肝脏和肌肉中糖原水平升高,而肠道内容物和粪便中葡萄糖水平较对照组低。4-FDG吸收试验显示,H-DHA组口服4-FDG后吸收更有效。此外,与对照组相比,H-DHA组葡萄糖转运相关蛋白GLUT2和SGLT1的表达以及mTOR通路的激活增强。L-DHA组在这些方面也显示出相似但较不明显的改善。 结论 我们的研究结果表明,哺乳期母体DHA补充可通过增加葡萄糖转运体的表达改善离乳子代小鼠的运动表现、增强肠道葡萄糖吸收,并有益地改变肠道微生物组的结构。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
哺乳期母体DHA补充能否影响离乳子代小鼠的肠道葡萄糖吸收、组织糖原储存和运动表现,并调节肠道菌群?
核心机制
哺乳期母体DHA补充通过上调mTOR信号通路,增加空肠葡萄糖转运体GLUT2和SGLT1的表达,从而增强肠道葡萄糖吸收。
主要证据
H-DHA组空肠和回肠葡萄糖浓度升高,肠道内容物和粪便葡萄糖降低,4-FDG吸收试验显示血清4-FDG升高,肝脏和肌肉糖原增加,握力和游泳时间延长,同时Western blot显示GLUT2和SGLT1蛋白表达增加,mTOR、p70S6K、S6磷酸化水平升高。
研究意义
为倡导哺乳期母体DHA补充作为促进离乳子代肠道发育的可行策略奠定基础,但需在人体中进行临床试验验证。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物实验设计

研究哺乳期母体DHA补充对子代的影响

怀孕C57BL/6小鼠(GD16)随机分为三组,分别给予载体、低剂量DHA(150 mg/kg·天)和高剂量DHA(450 mg/kg·天),从GD18至PD21每日口服灌胃。断奶后幼鼠随机分配进行不同实验。

2

运动表现测试

评估母体DHA补充对子代运动能力的影响

在断奶后(PD21)对幼鼠进行前肢握力测试和负重游泳测试,记录握力和游泳时间。

3

肠道形态学分析

评估母体DHA补充对幼鼠小肠形态的影响

取空肠和回肠组织,固定、包埋、切片、H&E染色,测量绒毛高度、隐窝深度、绒毛宽度,计算V/C比值和绒毛表面积。

4

肠道菌群16S rRNA测序

分析母体DHA补充对子代粪便菌群结构和功能的影响

收集粪便样本,提取DNA,扩增V3-V4区,进行16S rRNA测序,分析α多样性、β多样性、菌群组成和功能预测。

5

蛋白质组学分析

全面分析母体DHA补充对空肠蛋白表达的影响

提取空肠组织蛋白质,酶解后进行LC-MS/MS(DIA模式)分析,鉴定差异表达蛋白,进行GO和KEGG富集分析。

6

葡萄糖吸收测试

评估母体DHA补充对子代肠道葡萄糖吸收功能的影响

口服葡萄糖和4-FDG后,在不同时间点测量血糖和血清4-FDG浓度,计算AUC。同时测量肠道组织和内容物以及粪便中的葡萄糖浓度,以及肝脏和肌肉中的糖原含量。

7

分子机制验证

探究母体DHA补充促进肠道葡萄糖吸收的分子机制

通过RT-qPCR和Western blot检测空肠组织中葡萄糖转运相关基因(GLUT2、SGLT1等)和mTOR信号通路相关蛋白的表达及磷酸化水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
二十二碳六烯酸Macklin--
羧甲基纤维素钠Solarbio--
糖原测定试剂盒Nanjing Jiancheng--
葡萄糖测定试剂盒Nanjing Jiancheng--
TC、TG、TP测定试剂盒Nanjing Jiancheng--
Eclipse 80i显微镜Nikon--
NIS-elements软件Nikon--
握力计 (SF-3)AIPLI--
血糖仪Bayer Healthcare LLC--
DNeasy PowerSoil试剂盒Qiagen--
QIAquick凝胶提取试剂盒Qiagen--
Qubit dsDNA HS检测试剂盒ThermoFisher--
MGISEQ-2000测序平台BGI Genomics--
JY92-IIDN超声破碎仪Scientz Biotechnology--
10 kDa超滤管Millipore--
胰蛋白酶Promega--
nanoElute超高效液相色谱Bruker Daltonics--
timsTOF Pro质谱仪Bruker Daltonics--
Trizol试剂 (RNAiso Plus)Takara--
Prime Script RT试剂盒Takara--
QuantStudio Dx实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
SYBR GREEN预混液Yeasen--
引物Sangon Biotech--
RIPA裂解液Beyotime Biotech--
磷酸酶抑制剂混合物Servicebio--
BCA蛋白定量试剂盒Beyotime Biotech--
PVDF-Plus膜Millipore--
GLUT2抗体AbclonalA12307
SGLT1抗体Biossbs-1128R
S6核糖体蛋白抗体Absinabs131865
磷酸化S6核糖体蛋白抗体Abcamab215214
p70S6激酶抗体Proteintech14485-1-AP
磷酸化p70S6激酶抗体Cell Signaling Technology9234
mTOR抗体AbmartT55306
磷酸化mTOR抗体Cell Signaling Technology5536
β-actin抗体AbmartT40104
二抗(山羊抗兔/小鼠IgG)Beyotime Biotech--
化学发光系统Pierce--
ChemiDOC XRS+成像系统Bio-Rad--
NanoDrop核酸定量仪----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物实验
DHA剂量:150 mg/(kg·day) 和 450 mg/(kg·day);给药方式:口服灌胃;给药时间:GD18至PD21;母鼠品系:C57BL/6;样本量:每组6只母鼠
阅读提示:Methods 2.1
运动测试
握力测试参数:SF-3握力计,每只测试5次,取平均值并归一化至体重;游泳测试参数:负重5%体重,水温25±1°C,记录力竭时间
阅读提示:Methods 2.6, 2.7
肠道形态学
测量指标:绒毛高度、隐窝深度、V/C比值、绒毛表面积;每组样本量:n=5-6
阅读提示:Methods 2.5
肠道菌群测序
引物:338F/806R;测序平台:MGISEQ-2000;每组样本量:n=5
阅读提示:Methods 2.9
蛋白质组学
组织:空肠;方法:LC-MS/MS(DIA模式);差异蛋白筛选:FC>1.5或<0.67,p<0.05;每组样本量:n=4
阅读提示:Methods 2.10
葡萄糖吸收测试
口服葡萄糖剂量:2 g/kg;口服4-FDG剂量:10 mg/kg;采血时间点:0, 15, 30, 60, 120 min;每组样本量:n=6-8
阅读提示:Methods 2.8
分子机制验证
检测基因/蛋白:GLUT2, SGLT1, mTOR等;Western blot抗体信息见Methods 2.12;每组样本量:n=4(蛋白)、n=7-8(mRNA)
阅读提示:Methods 2.11, 2.12