旋毛虫感染诱导宿主中性粒细胞增多及肠道中性粒细胞浸润
观察旋毛虫感染后宿主中性粒细胞的变化，为后续NETs研究提供基础。
对感染旋毛虫的C57BL小鼠在不同时间点进行血常规分析，并通过免疫组化检测肠道Ly6G阳性细胞。
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Plancitoxin-1介导寄生蠕虫旋毛虫逃避细胞外陷阱
Plancitoxin-1 mediates extracellular trap evasion by the parasitic helminth Trichinella spiralis.
实验完整度
高包含体外共培养、核酸酶活性检测、RNAi干扰、体内小鼠感染与免疫保护实验等多层级验证。
主要模型
小鼠骨髓中性粒细胞（PMNs） 小鼠巨噬细胞系J774A.1 旋毛虫不同发育阶段（成虫、肌幼虫、新生幼虫） C57BL/6小鼠和ICR小鼠感染模型
重点核对
ATA浓度25 μM抑制ES核酸酶活性 PMA浓度100 nM诱导NETs形成 RNAi siRNA-290浓度2 μM敲低Ts-Pt-1 感染剂量300 ML/鼠 anti-Ly6G mAb剂量0.5 mg/鼠，腹腔注射，从感染前1天至感染后3天
摘要
背景：旋毛虫（T. spiralis）是一种寄生性蠕虫，引起全球普遍存在而被忽视的人畜共患疾病，其不同发育阶段（肌幼虫、成虫、新生幼虫）在不同感染部位诱导免疫攻击，对宿主健康造成严重危害。几种先天免疫细胞释放细胞外陷阱（ETs）以诱捕并杀死侵入体内的大多数病原体。作为回应，一些单细胞病原体已进化出通过分泌核酸酶来逃避ETs捕获的策略，但有关多细胞蠕虫的研究很少。结果：在本研究中，我们观察到来自中性粒细胞的ETs捕获旋毛虫成虫，而来自巨噬细胞的ETs捕获肌幼虫和新生幼虫，且ETs在体外对寄生虫具有杀伤作用。为了防御这种免疫攻击，旋毛虫分泌plancitoxin-1，一种DNase II样蛋白，以降解ETs并逃避捕获，这对于旋毛虫在宿主中的生存至关重要。结论：总之，这些发现表明旋毛虫通过分泌脱氧核糖核酸酶逃避ET介导的捕获，作为一种潜在的保守免疫逃避机制，plancitoxin-1可作为潜在的疫苗候选分子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 旋毛虫是否能通过分泌核酸酶逃避宿主先天免疫细胞释放的细胞外陷阱的捕获，以及何种ES成分发挥核酸酶活性。
- 核心机制
- 旋毛虫分泌DNase II样蛋白plancitoxin-1，降解ETs的DNA骨架，从而逃避中性粒细胞和巨噬细胞ETs的捕获。
- 主要证据
- 体外共培养显示ETs可捕获并杀死旋毛虫；ES具有核酸酶活性且最适pH为5；重组Ts-Pt-1具有核酸酶活性；RNAi敲低Ts-Pt-1降低ES核酸酶活性并减弱寄生虫致病力，且中性粒细胞耗竭可恢复致病力。
- 研究意义
- 该机制可能是保守的免疫逃避机制，plancitoxin-1可作为潜在的疫苗候选分子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外共培养验证ETs释放及捕获旋毛虫
确定不同发育阶段的旋毛虫能否诱导中性粒细胞或巨噬细胞释放ETs并捕获虫体。
将旋毛虫成虫与小鼠骨髓中性粒细胞共培养，肌幼虫/新生幼虫与J774A.1巨噬细胞共培养，在含或不含ATA的培养基中，通过免疫荧光和SEM观察ETs形成。
ETs杀伤作用评估
评估ETs对旋毛虫的杀伤效应。
在含ATA培养基中，将成虫与PMNs、ML或NBL与J774A.1共培养，检测不同时间点存活虫数。
ES降解NETs及核酸酶活性表征
验证旋毛虫ES具有核酸酶活性，并能降解NETs的DNA骨架。
用PMA诱导NETs，加入AD3 ES观察NETs降解；用λDNA检测ES在不同pH、金属离子条件下的核酸酶活性。
质谱鉴定核酸酶为plancitoxin-1
鉴定ES中具有核酸酶活性的蛋白。
通过SDS-PAGE zymography检测核酸酶分子量，质谱分析候选蛋白，并在CHO细胞中表达重组蛋白验证其核酸酶活性。
RNAi敲低Ts-Pt-1验证其功能
通过RNAi敲低Ts-Pt-1，验证其对ES核酸酶活性和旋毛虫致病力的影响。
将肌幼虫用siRNA处理，检测Ts-Pt-1 mRNA和蛋白水平，收集ES检测核酸酶活性，并用siRNA处理后的ML感染小鼠，评估成虫和肌幼虫数量，同时设置中性粒细胞耗竭组。
免疫保护实验
评估rTs-Pt-1作为疫苗候选的免疫保护效果。
用重组rTs-Pt-1免疫ICR小鼠，然后感染旋毛虫，检测成虫和肌幼虫负担。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Corning | -- | |
| ES制备 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 中性粒细胞分离 | 分离液 | Solarbio | -- |
| 流式鉴定 | FITC-CD11b抗体 | Abcam | -- |
| PE-Ly6G抗体 | Abcam | -- | |
| 核染色 | Hoechst 33342染色液 | Sigma-Aldrich | -- |
| NETs染色 | SYTOX Green核酸染料 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光 | 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab61251 |
| 抗髓过氧化物酶抗体 | Abcam | ab9535 | |
| 抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体 | Abcam | ab21595 | |
| Alexa Fluor 555标记山羊抗兔IgG | Abcam | -- | |
| 显微镜观察 | 多聚赖氨酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| DNA定量 | PicoGreen荧光染料 | Yeasen | -- |
| DNA模板提取 | DNAzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 核酸酶活性检测 | 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 |
| λDNA | Sangon | -- | |
| SDS-PAGE酶谱 | 鲑鱼精子DNA | Sigma-Aldrich | -- |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| 溴化乙锭 | -- | -- | |
| 考马斯亮蓝 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成 | SuperScript II反转录cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 克隆表达 | pcDNA 3.1/His A载体 | Invitrogen | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 蛋白纯化 | His-Trap纯化试剂盒 | GE | -- |
| qPCR | ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| 半干转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| HRP标记的山羊抗猪IgG | Solarbio | -- | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | -- | |
| 增强化学发光试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 抗血清制备 | 完全弗氏佐剂 | Sigma | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma | -- | |
| 抗体纯化 | 蛋白A Sefinose亲和纯化树脂 | Sangon | -- |
| 免疫荧光定位 | Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG | Invitrogen | -- |
| RNAi | Stealth RNAi双链体 | Sangon | -- |
| FAM标记的对照siRNA | Sangon | -- | |
| 抗Ly6G单克隆抗体 | Abcam | -- | |
| 免疫保护 | 弗氏佐剂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ETs释放实验 | PMNs纯度（>85%）、细胞数量、虫体数量、共培养时间、ATA浓度、血清-free培养基 阅读提示：Methods: NET visualization by immunofluorescence analysis; Figure 1 legend |
| ETs杀伤实验 | 共培养时间（6、12、24、48 h）、虫体数量、存活虫数判断标准 阅读提示：Methods: Analysis of ET- or ADCP-mediated worm killing; Figure 2 legend |
| 核酸酶活性检测 | ES浓度、λDNA量、pH范围、金属离子条件、反应温度和时间 阅读提示：Methods: Detection of nuclease activity of AD3 ES; Figure 4 legend |
| RNAi敲低实验 | siRNA序列和浓度、ML数量、孵育时间、转染试剂用量 阅读提示：Methods: RNAi; Figure 6 legend |
| 中性粒细胞耗竭实验 | anti-Ly6G mAb剂量、给药时间、感染剂量、成虫和肌幼虫收集时间点 阅读提示：Methods: Nuclease activity detection of ES obtained from AD3 treated with siRNA; Figure 6 legend |
| 免疫保护实验 | rTs-Pt-1剂量、佐剂类型、免疫次数和间隔、感染剂量、成虫和肌幼虫收集时间点 阅读提示：Methods: Immunoprotective analysis of rTs-pt-1; Figure 6 legend |