NK细胞免疫状态分析
比较不同感染状态（HC、LTBI、ATB）个体外周血NK细胞的数量和功能特征。
通过FACS分析免疫细胞频率和绝对计数，通过RNA测序和GSEA分析NK细胞转录谱，通过共培养实验检测NK细胞功能。
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LILRB1-HLA-G轴定义驱动结核病中自然杀伤细胞耗竭的检查点
LILRB1-HLA-G axis defines a checkpoint driving natural killer cell exhaustion in tuberculosis.
实验完整度
高包含患者样本、体外细胞共培养、功能过表达、机制抑制剂、siRNA敲低、免疫人源化小鼠等多层级验证。
主要模型
人外周血NK细胞（HC/LTBI/ATB） Mtb感染的单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs） 免疫人源化NCG小鼠（移植人PBMCs） HEK293T细胞（用于LILRB1-HLA-G结合实验）
重点核对
NK细胞共培养模型需MOI=1感染MDMs 2小时，NK:MDM=5:1共培养24小时 LILRB1阻断使用10 μg/mL抗LILRB1抗体（GHI/75） HLA-G中和使用10 μg/mL抗HLA-G抗体（87G） 信号通路抑制剂：dabrafenib mesylate (5 μM)、SCH772984 (5 μM)、TPI-1、SHP099、NSC87877 (均为0.5 μM) 免疫人源化小鼠：PBMCs移植2周后，气溶胶感染~100 CFU Mtb，4周，每3天腹腔注射anti-LILRB1 pAb
摘要
慢性感染，包括由结核分枝杆菌（Mtb）引起的结核病（TB），可诱导宿主免疫耗竭。然而，参与此过程的关键检查点分子及其潜在调控机制在很大程度上仍不清楚，这阻碍了基于检查点的免疫疗法在感染性疾病中的应用。在此，通过采用飞行时间质谱流式细胞术和转录谱分析来系统分析自然杀伤（NK）细胞表面受体，我们确定了白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）作为一个关键的检查点受体，它定义了一个与TB相关的细胞亚群（LILRB1+ NK细胞），并在TB中驱动NK细胞耗竭。机制上，Mtb感染的巨噬细胞高表达人类白细胞抗原-G（HLA-G），它上调并激活NK细胞上的LILRB1，通过酪氨酸磷酸酶SHP1/2抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导，从而损害其功能。此外，LILRB1阻断在免疫人源化小鼠中恢复NK细胞依赖性抗Mtb免疫。因此，LILRB1-HLA-G轴构成TB中的NK细胞免疫检查点，并作为有前景的免疫治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结核病中NK细胞耗竭的关键检查点分子及其调控机制尚不清楚，本研究旨在鉴定驱动NK细胞耗竭的检查点分子并探究其机制。
- 核心机制
- Mtb感染的巨噬细胞高表达HLA-G，上调并激活NK细胞上的LILRB1，通过SHP1/2抑制MEK1/2-ERK1/2-ETS1 MAPK信号通路，导致NK细胞细胞毒功能受损和凋亡增加，从而驱动NK细胞耗竭。
- 主要证据
- 通过CyTOF和转录组分析发现ATB患者中LILRB1+ NK细胞亚群（C5）存在；过表达LILRB1损害NK细胞功能；抗HLA-G或抗LILRB1阻断抗体恢复NK细胞功能；免疫人源化小鼠中LILRB1阻断恢复抗Mtb免疫，且依赖NK细胞和MAPK信号。
- 研究意义
- LILRB1-HLA-G轴构成TB中NK细胞免疫检查点，是TB免疫治疗的有前景靶点，NK细胞检查点阻断是恢复宿主抗TB免疫的合理策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定TB相关NK细胞亚群
利用CyTOF分析NK细胞表面受体，鉴定与TB相关的NK细胞亚群。
对来自HC、LTBI、ATB组的NK细胞进行CyTOF检测39种免疫标志物，通过t-SNE和FlowSOM聚类分析。
验证LILRB1对NK细胞功能的影响
确定LILRB1表达是否足以驱动NK细胞耗竭表型。
通过逆转录病毒转导在NK细胞中过表达LILRB1，与Mtb感染的MDMs共培养，检测NK细胞功能。
探究HLA-G对LILRB1的调控
确定Mtb感染是否通过巨噬细胞上的HLA-G上调NK细胞LILRB1表达。
检测ATB患者血清可溶性HLA-G水平，用重组HLA-G处理NK细胞，用抗HLA-G中和抗体处理共培养体系。
解析LILRB1-HLA-G信号的机制
阐明LILRB1-HLA-G相互作用抑制NK细胞功能的分子机制。
通过免疫印迹检测信号蛋白磷酸化，用抑制剂和siRNA靶向MAPK和SHP1/2通路，分析NK细胞功能变化。
LILRB1阻断对ATB患者NK细胞亚群的影响
评估LILRB1阻断是否能增强TB相关NK细胞亚群的抗Mtb功能。
从ATB患者中分选CD3-CD56+CD4+CD14+ NK细胞，用抗LILRB1阻断抗体处理，与Mtb感染的MDMs共培养，检测杀伤活性。
免疫人源化小鼠体内验证
在体内验证LILRB1阻断是否能恢复宿主抗Mtb免疫。
将HC、LTBI、ATB供体的PBMCs移植到NCG小鼠，感染Mtb后用抗LILRB1 pAb治疗，评估肺部和脾脏细菌载量、病理和免疫细胞功能。
NK细胞依赖性验证
确认LILRB1阻断的效果是否依赖于NK细胞。
在免疫人源化小鼠中，使用CD56 MicroBeads去除NK细胞，比较去除后LILRB1阻断的效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Middlebrook 7H9培养基 | BD Biosciences | 271310 |
| 吐温-80 | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | |
| Middlebrook 7H10琼脂 | BD Biosciences | 262710 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT-1 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10091148 | |
| 人外周血淋巴细胞分离液 | DAKAWE | 7111011 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | SV30010 | |
| 细胞分化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Gibco | PHC9501 |
| NK细胞分选 | MojoSort人NK细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480054 |
| ELISA检测 | HLA-G ELISA试剂盒 | ABclonal | RK01849 |
| 信号通路抑制 | 甲磺酸达拉非尼 | Selleck | S5069 |
| SCH772984 | Selleck | S7101 | |
| TPI-1 | Selleck | S6570 | |
| SHP099 | Selleck | S8278 | |
| NSC87877 | Selleck | S8182 | |
| ELISA检测 | 人GZMB ELISA试剂盒 | DAKAWE | 1118502 |
| 人PRF1 ELISA试剂盒 | DAKAWE | 1118302 | |
| 流式细胞术 | Cytofix/Cytoperm固定/破膜试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1062 |
| 活细胞成像 | Hoechst 33342染料 | Cell Signaling Technology | 4082 |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 细胞毒性检测 | DRAQ7 | Cell Signaling Technology | 7406 |
| 钙黄绿素AM | Abcam | ab141420 | |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Dongsheng | R1061 |
| CyTOF | 细胞采集液 | Fluidigm | 201240 |
| EQ四元素校准微球 | Fluidigm | 201078 | |
| MaxPAR抗体标记试剂盒 | Fluidigm | 201153A | |
| 顺铂 | Fluidigm | 201064 | |
| 流式细胞术 | FACS缓冲液和破膜缓冲液 | eBioscience | 00833356 |
| 转染 | Hieff Trans脂质体转染试剂 | Yeasen | 40802ES02 |
| 重组蛋白处理 | HLA-G蛋白 | Solarbio | P05199 |
| 抗体标记 | ReadiLink xtra Rapid iFluor 647抗体标记试剂盒 | AAT Bioquest | 1963 |
| 蛋白提取 | 细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A琼脂糖 | Santa Cruz | sc-2001 |
| 逆转录病毒转导 | 聚凝胺 | Santa Cruz | sc-134220 |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| 脂质纳米颗粒制备 | ALC-0315 | MedChemExpress | HY-138170 |
| 胆固醇 | MedChemExpress | HY-N0322 | |
| 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | MedChemExpress | HY-W040193 | |
| DMG-PEG2000 | MedChemExpress | HY-112764 | |
| 细菌成分消化 | 蛋白酶K | Yeasen | 10401ES80 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Yeasen | 20124ES03 | |
| 变溶菌素 | Sigma-Aldrich | SAE0092 | |
| α-甘露糖苷酶 | Sigma-Aldrich | M7257 | |
| 抗体纯化 | 蛋白A/G琼脂糖 | Santa Cruz | sc-2003 |
| NK细胞去除 | 人CD56磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-401 |
| ELISA检测 | 人IFN-γ ELISA试剂盒 | RayBiotech | ELH-IFNg-1 |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | RayBiotech | ELH-TNFa-1 | |
| 免疫荧光 | AR6缓冲液 | AKOYA Biosciences | AR600250ML |
| 山羊血清封闭液 | CWBIO | CW0130 | |
| 荧光染料偶联TSA试剂 | FreeThinking | FS1010 | |
| 显微镜 | 奥林巴斯FV3000RS共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪（Fortessa） | BD Biosciences | -- |
| RNA测序 | Illumina HiSeq X Ten平台 | Novogene Bioinformatics Technology | -- |
| CyTOF | Helios CyTOF质谱流式细胞仪 | Fluidigm | -- |
| 组织匀浆 | FastPrep-24匀浆系统 | MP Biomedicals | -- |
| 病理扫描 | Aperio CS2扫描仪 | Leica Biosystems | -- |
| Pannoramic MIDI扫描仪 | 3D HISTECN | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NK细胞功能检测 | NK细胞与Mtb感染MDMs共培养比例（5:1）、MOI（1）、共培养时间（24小时） 阅读提示：Methods 'Macrophage-NK cell co-culture' |
| LILRB1表达分析 | CyTOF检测的NK细胞门控策略（CD3-CD19-CD56bright/dim）、CyTOF抗体克隆和金属标签、t-SNE和FlowSOM参数 阅读提示：Methods 'CyTOF detection and subsequent analysis' |
| LILRB1过表达 | 逆转录病毒转导系统（pMSCVpuro包装）、转导后NK细胞的选择（嘌呤霉素浓度）、LILRB1表达验证方法 阅读提示：Methods 'Retroviral transduction of NK cells' |
| 抗体阻断实验 | 抗体浓度：10 μg/mL (GHI/75, 87G)、小鼠IgG对照 阅读提示：Methods 'Macrophage-NK cell co-culture' |
| 信号通路抑制剂处理 | 抑制剂浓度：DM (5 μM), SCH772984 (5 μM), TPI-1 (0.5 μM), SHP099 (0.5 μM), NSC87877 (0.5 μM) 阅读提示：Methods 'Macrophage-NK cell co-culture' |
| 免疫人源化小鼠模型 | 小鼠品系（NCG）、年龄（8周）、PBMCs移植数量（5×10^6）、Mtb感染剂量（~100 CFU）、给药方案（anti-LILRB1 pAb每3天一次，SCH772984每2天一次） 阅读提示：Methods 'Immuno-humanized mouse infection' |