Uox基因敲除大鼠模型建立与表型分析
构建更接近人类嘌呤代谢的HUA大鼠模型，并观察肾脏尿酸排泄及WWC1表达变化
利用CRISPR-Cas9技术敲除大鼠Uox基因，通过Sanger测序验证，检测血清UA、CREA、BUN、XOD水平，肾脏组织学检查，Western blot检测OAT3、ABCG2和WWC1，RT-qPCR检测Wwc1 mRNA。
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WWC1上调通过Hippo信号通路减少肾脏尿酸排泄加速高尿酸血症
WWC1 upregulation accelerates hyperuricemia by reduction in renal uric acid excretion through Hippo signaling pathway.
实验完整度
高研究包含Uox敲除大鼠模型、HUA小鼠模型、HK2细胞模型，并通过siRNA敲低、质粒过表达、YAP1/YAP5SA过表达回补实验以及Western blot、RT-qPCR等进行了功能与机制验证。
主要模型
Uox基因敲除大鼠（Uox−/−） HUA小鼠模型（PO诱导） HK2人肾皮质近端肾小管上皮细胞
重点核对
Uox基因敲除大鼠的构建与基因型鉴定 HUA小鼠模型：腹腔注射PO（350 mg/kg，28天）加10%果糖水 HK2细胞HUA模型：腺苷（2.5 mM，30小时）和XOD（2.5 U/L，8小时）处理 WWC1 siRNA敲低和质粒过表达转染 YAP1和YAP5SA过表达回补实验
摘要
高尿酸血症（HUA）是一种以血清尿酸（UA）升高为特征的代谢性疾病，主要归因于肝脏尿酸生成过多和肾脏尿酸排泄减少。尽管与尿酸排泄减少相关的分子通路已被阐明，但HUA的病因仍 largely 未知。在我们的研究中，利用Uox基因敲除大鼠、HUA小鼠和细胞系模型，我们发现WWC1水平的升高与肾脏尿酸排泄减少相关。此外，通过敲低和过表达方法，我们发现WWC1抑制肾小管上皮细胞中的尿酸排泄。机制上，WWC1激活Hippo通路，导致下游转录因子YAP1磷酸化并随后降解，从而通过转录调控损害ABCG2和OAT3的表达。因此，这一减少导致肾小管上皮细胞中尿酸排泄减少。总之，我们的研究阐明了上调的WWC1在肾小管上皮细胞中抑制肾脏尿酸排泄并导致HUA的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- WWC1在肾脏尿酸排泄和高尿酸血症发病中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- WWC1上调通过激活Hippo通路，促进LATS1磷酸化，导致YAP1磷酸化并降解，进而抑制YAP1的核转位和转录活性，下调ABCG2和OAT3的表达，减少肾脏尿酸排泄，导致高尿酸血症。
- 主要证据
- Uox−/−大鼠、HUA小鼠和HUA细胞模型中WWC1升高伴随OAT3/ABCG2降低；siRNA敲低WWC1增加UA排泄和OAT3/ABCG2表达，过表达则相反；YAP1/YAP5SA过表达回补了WWC1过表达引起的UA排泄减少和转运蛋白下调。
- 研究意义
- 研究揭示了WWC1和YAP1在调控尿酸排泄中的关键作用，为高尿酸血症的预防和治疗提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HUA小鼠模型建立与表型分析
通过药物诱导建立HUA小鼠模型，验证肾脏尿酸排泄和WWC1表达变化
小鼠腹腔注射PO（350 mg/kg）并给予10%果糖水28天，检测血清UA、CREA、BUN、XOD，肾脏组织学，Western blot和RT-qPCR检测相关蛋白和mRNA。
HK2细胞HUA模型建立
在体外模拟高尿酸环境，研究WWC1表达对尿酸转运的影响
用腺苷和XOD处理HK2细胞，检测细胞外尿酸水平、OAT3/ABCG2蛋白和WWC1 mRNA/蛋白表达，免疫荧光观察WWC1定位。
WWC1敲低和过表达功能实验
验证WWC1对尿酸分泌和转运蛋白表达的影响
使用siRNA敲低WWC1或转染WWC1质粒过表达，检测细胞外和细胞内尿酸水平，Western blot检测OAT3、ABCG2、LATS1、p-LATS1、YAP1、p-YAP1，RT-qPCR检测SLC22A8、ABCG2 mRNA。
YAP1/YAP5SA回补实验
验证YAP1是WWC1调控UA转运蛋白表达的下游效应因子
在WWC1过表达的HK2细胞中共转染YAP1或YAP5SA质粒，检测细胞外/内UA水平、OAT3/ABCG2蛋白和mRNA表达。
机制验证：Hippo通路和YAP1核定位
验证WWC1通过Hippo通路抑制YAP1活性并影响其核转位
Western blot检测大鼠和小鼠肾脏及HK2细胞中LATS1、p-LATS1、YAP1、p-YAP1蛋白水平；提取细胞质和核蛋白检测YAP1分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 氧嗪酸钾 | Sigma | 156124 |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Pricella | PM150312 |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001 | |
| 青霉素/链霉素 | Solarbio | P8420/S8290 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo | 11668-019 |
| 质粒构建 | pcDNA3.1-HA载体 | Dahong | OENM_001161661 |
| pcDNA3.1-Flag载体 | mailgene | MG240311002 | |
| 基因表达分析 | TRIzol试剂 | Accurate | AG21102 |
| TransScript第一链cDNA合成SuperMix试剂盒 | Accurate | AG11706 | |
| ABScript II一步法SYBR Green RT-qPCR试剂盒 | ABclonal | RK21204 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Yamei | ZJ101 |
| Western blot | PVDF膜 | Merck | IPVH00010 |
| 抗WWC1抗体 | ABclonal | A17110 | |
| 抗ABCG2抗体 | CST | 42078 | |
| 抗OAT3抗体 | Proteintech | A3119 | |
| 抗YAP1抗体 | ABclonal | A1002 | |
| 抗p-YAP1(S127)抗体 | Abcam | ab76252 | |
| 抗LATS1抗体 | CST | 3477 | |
| 抗p-LATS1(Thr1079)抗体 | CST | 8654 | |
| AffiniPure山羊抗小鼠IgG (H+L) | Boster | BA1038 | |
| AffiniPure山羊抗兔IgG (H+L) | Boster | BA1039 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Advansta | K-12045-D50 | |
| 免疫荧光 | ABflo 555标记的山羊抗兔IgG (H+L) | ABclonal | AS057 |
| DAPI | Sigma | D5942 | |
| 免疫组化 | 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Bioss | -- |
| 生化分析 | UA、肌酐、BUN、XOD检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 仪器 | Veriti 96孔热循环仪 | Applied Biosystems | -- |
| Quawell紫外可见分光光度计Q5000 | Tripbiotech | -- | |
| Gentier 96E/96R实时荧光定量PCR检测系统 | Tianlong | -- | |
| 显微成像 | 光学显微镜 | OLYMPUS | -- |
| 蔡司显微镜 | ZEISS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Uox基因敲除大鼠模型 | Uox基因敲除大鼠的构建方法（CRISPR-Cas9）、基因型鉴定、使用的动物数量和性别、饲养条件 阅读提示：Rats and treatment 部分 |
| HUA小鼠模型 | 小鼠品系、周龄、性别、对照组和模型组的样本量、PO给药剂量和频率、果糖水的浓度、处理时间 阅读提示：Mice and treatment 部分 |
| 细胞模型 | 细胞系来源、培养条件（培养基、血清浓度、抗生素）、诱导剂浓度和处理时间（腺苷2.5 mM 30小时、XOD 2.5 U/L 8小时） 阅读提示：Cell cultures and transfection 部分 |
| 基因操作 | siRNA序列、siRNA转染浓度、质粒转染量、转染试剂（Lipofectamine 2000）的用量 阅读提示：Cell cultures and transfection 部分 |
| 蛋白检测 | 抗体稀释比例、抗体来源和货号，内参蛋白（GAPDH和LAMINB）的使用 阅读提示：Western blotting analysis 部分 |
| 基因表达检测 | 引物序列、RT-qPCR反应条件（退火温度、循环数）、内参基因（β-actin）的使用 阅读提示：Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) 部分 |
| 组织学检查 | 组织固定液（4%多聚甲醛）、固定时间、切片厚度、染色方法（HE） 阅读提示：Histopathological examination 部分 |
| 统计方法 | 统计方法（two-tailed unpaired Student's t-test）、显著性水平（p<0.05）、数据表达方式（mean ± SD） 阅读提示：Statistics and reproducibility 部分 |