血浆外泌体分离与鉴定
从活动性TAO患者和健康对照血浆中分离并验证外泌体。
采用尺寸排阻色谱（SEC）从血浆中分离外泌体，并通过Western blot、NTA和TEM进行鉴定。
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来自活动性甲状腺相关眼病患者的血浆外泌体诱导眼眶成纤维细胞炎症和纤维化
Plasma exosomes from patients with active thyroid-associated orbitopathy induce inflammation and fibrosis in orbital fibroblasts.
实验完整度
高包含患者样本和血浆外泌体的功能实验、RNA测序及miRNA机制验证等多个独立证据层级，并进行体外功能与机制研究。
主要模型
Thy-1+眼眶成纤维细胞（来自非活动性TAO患者原代培养） 活动性TAO患者血浆样本 健康对照血浆样本
重点核对
Pla-Exos来源：活动性TAO患者和健康对照 Thy-1+ OFs处理：Pla-Exos（50 µg/mL）或miR-144-3p mimics/inhibitors 检测时间点：mRNA检测为处理3天，蛋白检测为处理4天；转染后2天收细胞、3天收上清 细胞增殖检测：CCK-8法，0h、24h、48h、72h、96h 实验重复：功能实验3次独立重复，每组n=6
摘要
背景：甲状腺相关眼病（TAO）的发病机制尚未完全阐明。免疫细胞与眼眶成纤维细胞（OFs）之间的相互作用在眼眶炎症和纤维化中起关键作用。越来越多的报道表明，血浆外泌体（Pla-Exos）中有相当一部分来源于免疫细胞；然而，它们对OFs功能的影响尚不清楚。方法：OFs从非活动性TAO患者中原代培养。从活动性TAO患者和健康对照（HCs）的血浆样本中分离外泌体，用于功能和RNA货物分析。在胸腺细胞分化抗原-1阳性（Thy-1+）OFs中，功能分析检测了炎症和纤维化标志物（mRNA和蛋白质）的表达以及细胞对Pla-Exos的响应。RNA货物分析通过RNA测序和RT-qPCR进行。用miR-144-3p mimics/inhibitors转染Thy-1+ OFs，以评估其对炎症、纤维化和增殖的调控。结果：来源于活动性TAO患者的Pla-Exos（Pla-ExosTAO−A）在Thy-1+ OFs中诱导更强的炎症细胞因子和透明质酸（HA）产生，同时抑制其增殖。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析和单样本基因集富集分析（ssGSEA）表明，Pla-ExosTAO−A和Pla-ExosHC之间的mRNA表达差异与免疫细胞密切相关。差异表达分析显示，Pla-ExosTAO−A中有62个上调miRNA和45个下调miRNA，其中miR-144-3p在活动性TAO组的Pla-Exos和PBMCs中均升高。KEGG分析表明，差异表达miRNA和miR-144-3p的靶基因富集在免疫相关信号通路中。过表达miR-144-3p mimic显著上调Thy-1+ OFs中炎症细胞因子和HA的分泌，同时抑制其增殖。结论：来源于活动性TAO患者的Pla-Exos具有免疫活性，可能是TAO炎症和纤维化进展的长期刺激因素。我们的发现提示Pla-Exos可作为TAO患者的生物标志物或治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 活动性TAO患者血浆外泌体对眼眶成纤维细胞功能有何影响，以及其可能的分子机制。
- 核心机制
- 活动性TAO患者血浆外泌体中上调的miR-144-3p可诱导Thy-1+ OFs炎症和纤维化，并抑制其增殖。
- 主要证据
- 活动性TAO患者Pla-Exos处理Thy-1+ OFs增加炎症因子和HA产生并抑制增殖；miR-144-3p mimic模拟类似效应，而miR-144-3p inhibitor消除上述效应。
- 研究意义
- 表明血浆外泌体可能是TAO的长期炎症和纤维化进展的刺激因素，可作为TAO患者的生物标志物或治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
眼眶成纤维细胞原代培养及Thy-1+分选
获取用于功能实验的Thy-1+眼眶成纤维细胞。
从非活动性TAO患者眼眶结缔组织中分离原代OFs，并通过CD90磁珠分选获得Thy-1+ OFs，经流式细胞术验证纯度。
Pla-Exos处理Thy-1+ OFs的功能实验
检测活动性TAO来源的血浆外泌体对Thy-1+ OFs炎症、纤维化和增殖的影响。
将Pla-Exos（50 µg/mL）与Thy-1+ OFs共培养，检测炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL2、RANTES）和HA相关指标（HAS1、HA）的表达，并用CCK-8法检测细胞增殖。
外泌体RNA内容分析
比较活动性TAO和健康对照血浆外泌体的RNA表达谱，寻找潜在功能分子。
对两组外泌体RNA进行RNA-seq（mRNA、lncRNA、miRNA），筛选差异表达RNA，并进行KEGG通路和ssGSEA分析。
miR-144-3p在PBMCs中的表达验证
验证候选miRNA是否来源于免疫细胞。
通过RT-qPCR检测活动性TAO患者和健康对照PBMCs中miR-134-5p、miR-144-3p、miR-431-5p、miR-483-3p的表达水平。
miR-144-3p功能验证
验证miR-144-3p是否直接参与Thy-1+ OFs的炎症、纤维化和增殖调控。
用miR-144-3p mimics或inhibitors转染Thy-1+ OFs，检测炎症因子、HA相关指标和细胞增殖的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 外泌体分离 | Exosupur® 色谱柱 | Echobiotech | 35 nm |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 外泌体浓缩 | Amicon® 超滤管 | Merck | 100 kDa |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| CD63抗体 | Abcam | ab68418 | |
| Alix抗体 | Proteintech | 12422-1-AP | |
| TSG101抗体 | Abcam | ab125011 | |
| Calnexin抗体 | Proteintech | 10427-2-AP | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Beyotime | A0208 | |
| 化学发光试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| iBright FL500成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 外泌体表征 | ZetaView PMX 110纳米颗粒分析仪 | Particle Metrix | -- |
| 透射电镜 | H-7650透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque™ PREMIUM 分离液 | Cytiva | -- |
| SEPMATE-15管 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 红细胞裂解液 | Beyotime | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Biological Industries | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | -- | |
| 0.05%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 细胞分选 | CD90磁珠（人） | Miltenyi Biotec | -- |
| LS分选柱 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 手动MACS磁力分离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 流式分析 | APC标记的小鼠抗人Thy-1（CD90）抗体 | BD Biosciences | -- |
| APC标记的小鼠IgG1κ同型对照抗体 | BD Biosciences | -- | |
| BD Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫荧光 | FSP抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4200821 |
| Vimentin抗体 | Abcam | ab137321 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠IgG二抗 | Bioss | -- | |
| Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG二抗 | Bioss | -- | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 抗荧光淬灭剂 | Beyotime | -- | |
| Leica DM4B显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 外泌体标记和示踪 | PKH67染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| 共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 细胞培养和处理 | 去除外泌体的胎牛血清 | System Biosciences | Exo-FBS-50 A-1 |
| 细胞转染 | attractene转染试剂 | QIAGEN | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Beyotime | -- |
| RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| RNA定量 | Multiskan Mk3酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录 | HiScript®III RT SuprtMix（含gDNA去除）逆转录试剂盒 | Vazyme | -- |
| PCR扩增 | Applied Biosystems Veriti PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | Taq Pro通用型SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| QuantStudio™ 3实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA测序建库 | QIAseq miRNA文库构建试剂盒 | QIAGEN | -- |
| SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒v2 | TAKARA | -- | |
| RNA测序质控 | Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| CXCL2 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| RANTES ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| HA ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| CCK-8检测 | CCK-8溶液 | Beyotime | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血浆外泌体分离 | 外泌体分离方法（SEC）、样本来源、样本处理条件（离心、过滤） 阅读提示：Methods: Exosome isolation |
| 原代OFs培养与Thy-1+分选 | 组织来源（非活动性TAO患者）、培养条件（DMEM/F-12+20% FBS）、分选方法（CD90磁珠两轮） 阅读提示：Methods: Cell preparation |
| Pla-Exos处理Thy-1+ OFs | 外泌体浓度（50 µg/mL）、处理时间（mRNA 3天、蛋白4天）、培养基（10% exosome-depleted FBS） 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment; Figure legends 3 |
| RT-qPCR分析 | 内参基因（mRNA用GAPDH，外泌体miRNA用miR-33a-5p，细胞miRNA用U6）、样本量 阅读提示：Methods: RNA isolation and RT-qPCR |
| miR-144-3p转染 | mimics浓度（100 nM）、inhibitors浓度（200 nM）、转染试剂（attractene）、检测时间（2天RNA/3天上清） 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种数（3000细胞/孔）、CCK-8孵育时间（1.5h）、检测时间（0-96h） 阅读提示：Methods: CCK-8 assay |