筛选调节HR的G4结合蛋白
鉴定可能抑制G4位点HR的G4结合蛋白。
从G4IPDB数据库选择主要参与DNA代谢和损伤修复的G4结合蛋白，利用1000 Genomes Project的遗传图谱计算其结合位点的平均重组率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
YY1参与人细胞中鸟嘌呤四链体位点的同源重组抑制
YY1 is involved in homologous recombination inhibition at guanine quadruplex sites in human cells.
实验完整度
高包含体外细胞实验（SCE、ChIP、CUT&Tag、免疫荧光）、生化实验（EMSA、CD）及多组学生物信息分析，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 NCI-H125细胞
重点核对
BLM敲低（shBLM）诱导G4介导的HR，YY1敲低（shYY1）协同增强SCE YY1过表达（OE.YY1）逆转shBLM+shYY1导致的SCE增加 G4配体PDS和TMPyP4处理增加SCE和RAD51在G4位点的富集 RAD51 ChIP-qPCR在三个G4位点（由BG4 CUT&Tag和YY1 ChIP-seq确定）的富集变化 免疫荧光检测BG4和RAD51共定位
摘要
同源重组（HR）是修复DNA双链断裂和促进遗传多样性的关键过程。然而，HR在整个基因组中并非均匀发生，某些基因组特征可影响其活性。其中一个特征是鸟嘌呤四链体（G4s）的存在，这是一种广泛分布于基因组中的稳定二级结构。这些G4在基因转录和基因组稳定性调控中发挥重要作用。特别是在缺乏布鲁姆综合征解旋酶（BLM）的细胞中，G4水平升高显著增强G4位点的HR，可能威胁基因组稳定性。在此，我们研究了G4结合蛋白阴阳1（YY1）在人细胞中调节G4位点HR的作用。我们的结果表明，YY1与G4结构的结合抑制BLM敲低后的姐妹染色单体交换，且YY1的染色质占据与基因组中观察到的总体HR率呈负相关。通过限制RAD51同源物1（RAD51）的访问，YY1优先结合到关键基因组区域，保护它们免受过度HR的影响。我们的发现揭示了YY1-G4相互作用的新作用，为HR调控的细胞机制提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞中是否存在抑制G4位点同源重组的机制，以及G4结合蛋白YY1在其中扮演什么角色？
- 核心机制
- YY1通过结合G4结构，限制RAD51在G4位点的染色质定位，从而抑制这些位点的同源重组。
- 主要证据
- 在HEK293T和NCI-H125细胞中，YY1敲低加重BLM缺失诱导的SCE增加；YY1 ChIP-seq峰位于低重组率区域；YY1敲低增强BLM缺失时RAD51在G4位点的ChIP富集；免疫荧光显示BLM和YY1共敲低增加G4与RAD51共定位。
- 研究意义
- 作者提出YY1-G4相互作用是抑制HR冷点形成和保守基因保护的关键机制，并建议开发靶向YY1-G4相互作用的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证YY1对G4介导HR的抑制作用
确定YY1是否在细胞水平抑制BLM缺陷诱导的G4介导HR。
在HEK293T和NCI-H125细胞中，使用shRNA敲低BLM、YY1或两者，或过表达YY1，通过SCE实验检测HR水平。
评估YY1对G4水平的影响
检验YY1敲低或过表达是否通过改变G4水平影响HR。
使用BG4抗体进行免疫荧光检测，比较YY1敲低、过表达和对照细胞的G4水平。
分析YY1染色质占据与重组率的关系
在全基因组水平探究YY1结合位点与重组率的关系。
利用YY1 ChIP-seq数据和遗传图谱，比较YY1结合位点与随机区域的重组率，以及G4位点是否与YY1重叠对重组率的影响。
检测G4配体处理对HR和RAD51招募的影响
验证YY1通过G4结合抑制HR，以及G4配体竞争YY1结合后对HR和RAD51的效应。
用G4配体PDS或TMPyP4处理HEK293T细胞，通过SCE实验和RAD51 ChIP-qPCR检测HR水平和RAD51在G4位点的富集。
验证YY1抑制RAD51在G4位点的招募
检验YY1是否通过限制RAD51进入G4位点来抑制HR。
在HEK293T细胞中敲低BLM、YY1或两者，通过RAD51 ChIP-qPCR和免疫荧光检测RAD51在G4位点的富集和共定位。
分析YY1结合位点与重组热点及基因功能的关系
评估YY1抑制HR的生理意义，即是否保护必需基因。
比较YY1、PRDM9、H3K4me3和DMC1 ChIP-seq峰的重组率、MAF、CRISPR score和基因组分布，进行GO分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher | -- |
| 胎牛血清 | Adamas life | -- | |
| 细胞转染 | Lipo293™转染试剂 | Beyotime | -- |
| SCE实验 | 5-溴-2'-脱氧尿苷 | AbMole Bioscience | -- |
| 秋水仙胺 | Rhawn | -- | |
| 吖啶橙 | Macklin | -- | |
| Leica SP8激光扫描显微镜 | Leica | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| ECL蛋白质印迹检测试剂 | Amersham | -- | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715S | |
| RAD51抗体 | Abcam | ab133534 | |
| GAPDH抗体 | Bioshare | SB-AB0038 | |
| BLM抗体 | Proteintech | 30254-1-AP | |
| BRCA1抗体 | Proteintech | 22362-1-AP | |
| SP1抗体 | Abways | CY6610 | |
| NCL抗体 | Abways | CY7366 | |
| YY1抗体 | Santa Cruz | sc-7341 | |
| ChIP | 蛋白A+G琼脂糖珠 | Beyotime | P2055 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| BG4抗体 | -- | -- | |
| 抗Flag免疫共沉淀磁珠 | Bioshare | SB-PR002 | |
| UNIQ-10柱微量DNA凝胶回收试剂盒 | Sangon | B511139-0050 | |
| RT-qPCR | Promega总RNA提取试剂盒 | Promega | LS1040 |
| 逆转录酶 | Bioshare | SB-RT001 | |
| 2×通用SYBR Green qPCR预混液 | Vazyme | Q312-02 | |
| 实时荧光定量PCR检测系统（StepOne PLUS） | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | pSANG10-3F-BG4质粒 | Addgene | #55756 |
| His标签纯化树脂 | Beyotime | P2233 | |
| 空亲和层析柱试剂盒 | Beyotime | FCL03 | |
| Addgene #124601 | Addgene | #124601 | |
| CUT&Tag | 刀豆蛋白A磁珠 | Beyotime | P2156 |
| 小鼠IgG同型对照 | Share-bio | SB-A00001 | |
| Flag标签小鼠单克隆抗体 | Share-bio | SB-AB0008 | |
| 兔抗小鼠IgG H&L抗体 | Bioss | bs-0296R | |
| DNA筛选磁珠 | Yeason | 12601ES | |
| NEBNext Ultra II Q5预混液 | NEB | M0544 | |
| 凝胶回收试剂盒 | Sangon Biotech | B511139 | |
| Illumina Novaseq-PE150测序平台 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | 脱脂奶粉 | Beyotime | P0216 |
| Flag标签小鼠单克隆抗体 | Share-bio | AB0008 | |
| 兔抗Rad51抗体 | Abcam | ab133534 | |
| 山羊抗兔IgG(H+L) Alexa Fluor 594 | Share-bio | SB-AB0151 | |
| 山羊抗小鼠IgG(H+L) Alexa Fluor 488 | Share-bio | SB-AB0142 | |
| 粘附性显微镜载玻片 | Titan | 02036395 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0126 | |
| Leica Stellaris 5冷冻共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| EMSA | RAD51蛋白 | Elabscience | PDEH100341 |
| SYBR Gold核酸染料 | Invitrogen | -- | |
| Bio-Rad CFX Opus 96成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| CD光谱 | Jasco-815圆二色光谱仪 | Jasco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SCE实验 | 细胞系（HEK293T或NCI-H125）、转染质粒（shBLM、shYY1、OE.YY1）、转染时间48小时、BrdU标记时间40小时、秋水仙胺浓度0.05 μg/ml、处理时间2小时、样本量n>200 阅读提示：Materials and methods: Sister chromatid exchange (SCE) assay; Figure 1 |
| ChIP-qPCR | G4配体PDS浓度20 μM或TMPyP4浓度5 μM处理时间12小时、敲低处理时间48小时、抗体（RAD51 ab133534、YY1 sc-7341、H3K4me3 Ab8580、BG4）、染色质量800 ng、抗体量1 μg（BG4为500 ng）、目标G4位点 阅读提示：Materials and methods: Chromatin immunoprecipitation (ChIP); Figure 3 |
| CUT&Tag | 细胞数量2×10^5、甲醛固定浓度0.1%时间2分钟、抗体（BG4、IgG对照）浓度和孵育时间、pA-Tn5浓度、标签化时间1小时、测序平台Illumina Novaseq-PE150 阅读提示：Materials and methods: Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag); Figure 3 |
| 免疫荧光 | 细胞数量1×10^5、转染时间48小时、BG4浓度1 nM、抗体稀释度（Flag 1:1000、Rad51 1:1000）、二抗稀释度1:1000、生物学重复3次 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence microscopy; Figure 3D-E |