血清EVs的分离与表征
确定妊娠不同阶段血清EVs和sEVs的浓度、粒径及形态。
从非妊娠和妊娠小鼠血清中分离EVs，通过NTA测量粒径和浓度，通过TEM观察形态。
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小鼠妊娠血清中小细胞外囊泡的出现及其在胎盘中的定位
Appearance of small extracellular vesicles in the mouse pregnant serum and the localization in placentas.
实验完整度
高包含体外EVs分离与表征（NTA、TEM、Western blot）、组织学定位（IHC）及分子检测（qPCR）等多个独立证据层级，并进行功能验证。
主要模型
ICR小鼠妊娠模型 小鼠胎盘组织 血清来源的细胞外囊泡
重点核对
小鼠品系：ICR，购自Japan SLC 妊娠分期：阴道栓确认后记为Gd 0.5 EVs分离：使用Invitrogen Total Exosome Isolation试剂盒 sEVs粒径范围：30-150 nm qPCR检测目标miRNA：miR-10b-3p、miR-25b-3p、miR-143-3p、miR-379-3p
摘要
外泌体或小细胞外囊泡（sEVs）存在于怀孕小鼠的血液中，并被认为参与妊娠生理。虽然妊娠期的sEVs被认为来源于胎盘，但小鼠胎盘中产生sEVs的细胞尚不十分清楚。我们研究了妊娠血清和胎盘中sEVs的动态变化和定位，并检测了microRNA（miRNA）的妊娠期变化。从非妊娠（NP）和整个妊娠日（Gd）的小鼠收集血清和胎盘。从血清中纯化EVs，并从EVs中分离总RNA。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，sEVs在EVs中的比例在NP时为53%，在Gd 14.5时增加到80.1%，在Gd 18.5时增加到97.5%。EVs的Western blotting对四旋蛋白标记物呈阳性反应，并表明使用抗CD63抗体的结果与NTA检测到的sEVs出现最为一致。血清EVs对合体滋养层标记物syncytin-1也呈阳性反应。使用抗CD63抗体的免疫组织化学染色显示，小鼠胎盘的合体滋养层和胎儿毛细血管内皮细胞呈阳性反应。定量PCR显示，Gd 18.5的sEVs中含有显著较高量的miRNA。我们的结果表明，sEVs在小鼠胎盘中产生，并转移到母体或胎儿血流中。sEVs有望具有miRNA介导的生理效应，并成为反映妊娠状态的有用生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小鼠妊娠血清中sEVs的动态变化及其在胎盘中的定位，以及相关miRNA的表达变化。
- 核心机制
- sEVs由胎盘合体滋养层和胎儿毛细血管内皮细胞产生，并释放到母体或胎儿血液中，可能通过携带miRNA介导妊娠相关的生理效应。
- 主要证据
- NTA显示妊娠后期sEVs比例和浓度显著增加；Western blot检测到CD63和syncytin-1阳性；IHC定位CD63在合体滋养层和内皮细胞；qPCR显示特定miRNA（miR-10b-3p、miR-25b-3p、miR-143-3p）在Gd 18.5升高。
- 研究意义
- 研究结果为正常妊娠过程、异常妊娠的病理分析及妊娠失败监测分子的开发提供有用信息。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EVs的蛋白标记物分析
评估四旋蛋白标记物（CD9、CD63、CD81）与sEVs动态变化的一致性，并检测胎盘来源标记。
对EVs进行Western blot，检测CD9、CD63、CD81和syncytin-1的表达，并进行定量分析。
胎盘中sEVs的免疫组织化学定位
确定sEVs在小鼠胎盘组织中的细胞来源和定位。
对Gd 18.5胎盘组织切片进行免疫组织化学染色，检测CD9、CD63和CD81的表达，并用IRS评分评估。
血清EVs中miRNA的检测
比较非妊娠和妊娠末期血清EVs中特定miRNA的表达水平。
从血清EVs中提取RNA，通过qPCR检测miR-10b-3p、miR-25b-3p、miR-143-3p、miR-379-3p的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EVs分离 | Invitrogen总外泌体分离试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NTA | NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | -- |
| TEM | H-7100电子显微镜 | Hitachi High-Technologies | -- |
| 免疫组织化学 | Histofine Simple Stain Mouse MAX-PO（R）试剂盒 | Nichirei | -- |
| 过氧化物酶染色DAB试剂盒 | Nacalai Tesque | -- | |
| Western blot | eComplete mini，无EDTA | Roche | -- |
| Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | -- | |
| Bolt Bis-Tris Plus凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Merck KGaA | -- | |
| ECL Pro蛋白质印迹检测试剂 | PerkinElmer | -- | |
| Amersham ImageQuant 800 | Cytiva | -- | |
| 抗CD63抗体 | Abcam | -- | |
| 抗syncytin-1抗体 | Bioss | -- | |
| 抗CD9抗体 | Abcam | -- | |
| 抗CD81抗体 | Abcam | -- | |
| miRNA检测 | 总外泌体RNA和蛋白质分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Mir-X miRNA第一链合成试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| TB Green Advantage qPCR预混液 | Takara Bio | -- | |
| CFX96检测系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 实验动物 | 小鼠品系：ICR；饲养环境：温度22±2°C，12-12小时光暗循环；妊娠分期：阴道栓确认后记为Gd 0.5；样本数量：每个妊娠日至少3只。 阅读提示：Materials and Methods: Laboratory animals |
| EVs分离 | 血清分离：离心；细胞碎片去除：2000×g 30分钟 4°C；EVs沉淀：使用Invitrogen Total Exosome Isolation试剂，2-8°C孵育30分钟，10000×g离心10分钟。 阅读提示：Materials and Methods: Isolation of extracellular vesicles |
| NTA | 仪器：NanoSight NS300；测量次数：5次；sEVs粒径范围：30-150 nm；样品稀释：用过滤的PBS。 阅读提示：Materials and Methods: Nanoparticle-tracking assay |
| Western blot | 蛋白浓度调整至40 mg/mL；抗体：抗CD9、CD63、CD81、syncytin-1；检测：ECL Pro试剂。 阅读提示：Materials and Methods: Western blot |
| 免疫组织化学 | 组织：Gd 18.5胎盘；固定：10%中性缓冲福尔马林；抗原修复：Tris缓冲液pH 6.0 121°C 15分钟；抗体：抗CD9、CD63、CD81；检测：DAB；评分：IRS。 阅读提示：Materials and Methods: Immunohistochemistry |
| miRNA检测 | RNA提取：Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit；qPCR：CFX96，TB Green Advantage qPCR Premix；内参：U6sn RNA；统计分析：ΔΔCt法。 阅读提示：Materials and Methods: Detection of microRNA |