低剂量率照射小鼠肠道中G6PC2和MUC6与炎症性肠病的可能关联

Possible association of G6PC2 and MUC6 induced by low‑dose‑rate irradiation in mouse intestine with inflammatory bowel disease.

作者信息Sohi Kang, Min Ji Bae, Min Kook Kang, Hyojin Kim, Yeong-Rok Kang, Wol Soon Jo, Chang Geun Lee, Bokyung Jung, Jeongmin Lee, Changjong Moon, Yeonghoon Son, Hae-June Lee, Joong Sun Kim
PMID38785154
发布时间2024-07
DOI10.3892/mmr.2024.13251

实验完整度

包含动物模型(BALB/c小鼠)LDR IR暴露、RNA-seq筛选、RT-qPCR验证、Western blot蛋白验证及DSS诱导IBD模型,但缺乏体内功能验证和机制研究。

主要模型

BALB/c小鼠空肠 DSS诱导的IBD小鼠模型

重点核对

LDR IR剂量为10, 100, 500 mGy,剂量率为6.0 mGy/h 照射后取样时间点为1和24小时 重复照射次数为单次或三次(10 mGy×3次) DSS诱导IBD浓度为5% DSS溶于饮用水,持续7天 样本量为每组3只小鼠

摘要

尽管辐射暴露有多种类型,但低剂量率(LDR)照射(IR)是否影响机体仍存在争议。由于小肠是辐射敏感器官,本研究旨在评估其暴露于LDR IR时的变化,并鉴定对这些剂量敏感的基因。在经历LDR(6.0 mGy/h)γ射线照射后,于照射后1和24小时提取BALB/c小鼠的肠道RNA。使用小鼠全基因组微阵列探索辐射诱导的转录改变。使用逆转录-定量(RT-q)PCR检测时间和剂量依赖性辐射反应。10 mGy的LDR IR未改变受辐射小鼠空肠的组织病理学状态;然而,在暴露后1和24小时,小鼠空肠中23个基因因LDR IR而表达上调。选择上调基因以验证RNA测序分析结果用于RT-qPCR检测,结果显示,仅在LDR IR后24小时,Na+/K+转运亚基α4、葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基2(G6PC2)、黏蛋白6(MUC6)和瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员6的水平显著升高。此外,根据蛋白质印迹分析的蛋白表达,G6PC2和MUC6是LDR IR暴露诱导的显著基因。在三种条件下,G6PC2和MUC6的mRNA水平在24小时内显著升高:i) 暴露于LDR IR,ii) 重复暴露于LDR IR,iii) 在炎症性肠病存在下暴露于LDR IR。这些结果可能有助于更好地理解即时辐射反应以及开发生物标志物,以在组织病理学变化变得明显之前识别辐射易感个体。然而,要实现这一目标,需要进一步研究涉及G6PC2和MUC6的具体机制。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
低剂量率照射(LDR IR)如何影响小鼠空肠,以及哪些基因对这种剂量敏感?
核心机制
文中未明确说明G6PC2和MUC6上调的具体分子机制,但推测可能与LDR IR诱导的炎症反应相关。
主要证据
RNA-seq筛选出23个差异表达基因,RT-qPCR验证了G6PC2和MUC6的mRNA表达上调,Western blot验证了蛋白表达上调,且DSS诱导的IBD模型中表达进一步增加。
研究意义
作者提出G6PC2和MUC6可能作为识别辐射易感个体的生物标志物,并有助于理解即时辐射反应,但需进一步研究其机制。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物模型建立与照射

建立小鼠LDR IR暴露模型,观察空肠的早期反应。

90只6周龄雌性BALB/c小鼠(体重18-21g)分为对照组和照射组,接受6.0 mGy/h的137Cs源LDR γ射线照射,累积剂量为10, 100, 500 mGy,照射后1和24小时取样。

2

基因表达筛选

筛选LDR IR后空肠中表达变化的基因。

提取空肠总RNA,进行mRNA文库制备和HiSeq 2500测序,通过STAR比对和DESeq分析,鉴定差异表达基因。

3

RT-qPCR验证

验证RNA-seq筛选出的候选基因的表达变化。

对23个上调基因进行RT-qPCR检测,使用SYBR Green染料法,以GAPDH为内参,2^-ΔΔCq方法分析。

4

Western blot验证

在蛋白水平验证候选基因的表达变化。

空肠组织裂解后,进行SDS-PAGE电泳,转膜,孵育一抗和二抗,化学发光检测。

5

剂量和重复照射效应验证

验证G6PC2和MUC6对LDR IR的剂量依赖性和重复照射效应。

对空肠和结肠组织分别给予10, 100, 500 mGy LDR IR和500 mGy HDR IR,以及单次或三次10 mGy照射,检测mRNA表达。

6

DSS诱导IBD模型验证

研究LDR IR与炎症性肠病共存时G6PC2和MUC6的表达变化。

用5% DSS诱导小鼠IBD,然后进行三次10 mGy LDR IR,照射后1和24小时取材,进行组织学检查和基因表达分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
阿法沙龙Jurox Pty Ltd.--
异氟烷----
铯-137源----
Motic Easyscan数字切片扫描仪Motic Incorporation, Ltd.--
葡聚糖硫酸钠MP Biomedicals160110
TRIzol试剂Thermo Fisher Scientific, Inc.15596026
无RNase的DNase IThermo Fisher Scientific, Inc.EN0521
Nanodrop 2000分光光度计Thermo Fisher Scientific, Inc.--
BioAnalyzer2100生物分析仪Agilent Technologies, Inc.--
NEXTflex Poly (A)磁珠Bioo Scientific Corp.--
NEXTflex快速定向RNA测序文库制备试剂盒2.0Bioo Scientific Corp.--
Agencourt AMPure XP磁珠Beckman Coulter, Inc.--
HiSeq 2500测序平台Illumina, Inc.--
ISOGEN试剂盒Nippon Gene311-02501
CFX Opus 96仪器Bio-Rad Laboratories--
TOPreal SYBR Green qPCR 2x预混液EnzynomicsRT500M
Bio-Rad蛋白 assay试剂Bio-Rad Laboratories500-0006
Immobilon-PSQ转印膜MilliporeSigmaISEQ00010
抗ATP1A4抗体St John's Laboratory Ltd.STJ117451
抗G6PC2抗体BIOSSbs-13386R
抗MUC6抗体United States Biological224329
抗TRPV6抗体Alomone LabsACC-036
多克隆抗兔二抗MilliporeSigma12-348
化学发光试剂Thermo Fisher Scientific34580
ChemiDoc MP成像系统Bio-Rad Laboratories, Inc.--
抗β-肌动蛋白抗体MilliporeSigmaA5441

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
小鼠品系、性别、年龄、体重、饲养条件
阅读提示:Materials and methods: Animals
辐射暴露
辐射剂量率、累积剂量、照射次数、间隔时间、取样时间
阅读提示:Materials and methods: Radiation exposure
组织学分析
固定、切片、染色时间、扫描仪型号
阅读提示:Materials and methods: Histological analysis
DSS诱导结肠炎
DSS浓度、分子量、处理时间
阅读提示:Materials and methods: Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis
RNA提取和质量控制
总RNA提取方法、DNA酶处理、RNA完整性要求
阅读提示:Materials and methods: Total RNA and mRNA Isolation
RNA测序分析
测序平台、读长、比对软件、差异表达阈值
阅读提示:Materials and methods: mRNA sequencing library preparation and sequencing; Transcriptome mapping and data analysis
RT-qPCR
引物序列、反应体系、热循环条件、内参基因
阅读提示:Materials and methods: RT-qPCR analysis
Western blot
蛋白提取缓冲液、上样量、抗体稀释比、内参
阅读提示:Materials and methods: Western blot analysis
统计分析
每组样本量、重复数、统计方法、显著性阈值
阅读提示:Materials and methods: Statistical analysis