扶正解毒散通过激活PI3K/AKT通路抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒

Fuzhengjiedu San inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus by activating the PI3K/AKT pathway.

作者信息Kexin Chang, Kuangshi Fan, Hua Zhang, Qiong Wu, Yonghong Zhang, Le Wang, Hongcen Chen, Jinjin Tong, Defeng Cui
PMID38709810
期刊PLoS One
发布时间2024-05-06
DOI10.1371/journal.pone.0283728

实验完整度

网络药理学预测结合体外细胞实验验证,包括qRT-PCR、Western blot、流式细胞术检测凋亡,但缺乏动物模型等体内验证。

主要模型

MARC-145细胞 PRRSV JXA-1毒株感染MARC-145细胞模型

重点核对

MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞) PRRSV JXA-1毒株(GenBank accession no. EF112445.1; lineage 8.7) FZJDS浓度范围(0-128.00 mg/mL)及处理时间(24-72 h) PRRSV感染剂量(100 TCID50) FZJDS抑制PRRSV N蛋白和mRNA表达的检测(qRT-PCR和Western blot)

摘要

背景 传统中药(TCM)因其草药提取物和方剂被证明对疾病具有效力而受到越来越多的关注。扶正解毒散(FZJDS)已被广泛用于治疗猪病毒性疾病,但其生物活性成分和治疗机制仍不清楚。 方法 在本研究中,我们采用网络药理学和实验研究的综合方法阐明FZJDS治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用机制。我们构建了PPI网络,并根据度值筛选核心靶点。还进行了GO和KEGG富集分析以识别相关通路。最后,采用qRT-PCR、流式细胞术和Western blotting检测FZJDS对PRRSV感染的猴肾(MARC-145)细胞中核心基因表达的影响,以进一步扩展网络药理学分析的结果。 结果 网络药理学数据显示,槲皮素、山奈酚和木犀草素是FZJDS的主要活性化合物。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt通路被认为是细胞靶点,因为它已被证明最参与PRRSV复制和其他PRRSV相关功能。qRT-PCR和Western blotting分析表明,FZJDS显著降低了MARC-145细胞中P65、JNK、TLR4、N蛋白、Bax和IĸBa的表达,并增加了Bcl-2的表达,这与网络药理学结果一致。本研究提供FZJDS通过其对PI3K/AKT信号通路的作用具有显著的抗病毒活性。 结论 我们得出结论,FZJDS是治疗PRRSV的有前景的候选中药制剂,值得进一步研究。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
扶正解毒散(FZJDS)是否具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用,其活性成分和潜在分子机制是什么?
核心机制
FZJDS通过激活PI3K/AKT信号通路,调控凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)和炎症信号分子(TLR4、JNK、IĸBa)的表达,从而抑制PRRSV复制。
主要证据
网络药理学预测核心靶点和通路,结合qRT-PCR和Western blot显示FZJDS显著降低P65、JNK、TLR4、N蛋白、Bax和IĸBa表达,增加Bcl-2表达;流式细胞术显示FZJDS抑制PRRSV诱导的细胞凋亡。
研究意义
FZJDS是治疗PRRSV的有前景的候选中药制剂,为探索其他中药的治疗机制提供了参考。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

网络药理学预测活性成分和靶点

筛选FZJDS的活性成分并预测其抗PRRSV的潜在靶点。

利用TCMSP、ETCM、HERB数据库筛选FZJDS活性成分,从GeneCards、CTD、OMIM获取PRRSV相关靶点,取交集获得共同靶点,构建PPI网络并筛选核心靶点,进行GO和KEGG富集分析。

2

FZJDS细胞毒性检测

评估FZJDS对MARC-145细胞的毒性,确定安全给药浓度范围。

MARC-145细胞以2×10^4 cells/well接种96孔板,与不同浓度FZJDS孵育24-72 h,CCK-8法检测细胞活力,计算CC50和选择性指数。

3

FZJDS抗PRRSV活性检测

验证FZJDS抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制。

MARC-145细胞感染PRRSV(100 TCID50)1 h后,加入不同浓度FZJDS处理24-48 h,采用qRT-PCR和Western blot检测PRRSV N基因mRNA和蛋白表达。

4

FZJDS对PI3K/Akt信号通路的影响

验证FZJDS是否调控PI3K/Akt通路及其下游分子。

MARC-145细胞感染PRRSV(100 TCID50)1 h后,FZJDS处理48 h,Western blot检测P65、p-P65、JNK、p-JNK、IĸBa、p-IĸBa、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白表达。

5

FZJDS对PRRSV诱导凋亡的影响

评估FZJDS对PRRSV诱导细胞凋亡的抑制作用。

PRRSV感染MARC-145细胞后,FZJDS处理48 h,流式细胞术检测凋亡率;使用JNK抑制剂SP600125进一步验证JNK通路在凋亡中的作用。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Gibco--
胎牛血清Gibco--
青霉素-链霉素Gibco--
BAY 11-7082BeyotimeS1523
SP600125BeyotimeS1876
抗PRRSV N蛋白兔多克隆抗体Biossbs-23941R
抗TLR4兔单克隆抗体Biossbs-20379R
抗Bax小鼠单克隆IgG抗体Santa Cruzsc-7480
抗JNK1/2(D-9)小鼠单克隆IgG抗体Santa Cruzsc-137019
抗磷酸化JNK (G-7)小鼠单克隆IgG抗体Santa Cruzsc-6254
抗Bcl-2小鼠单克隆IgG抗体Santa Cruzsc-7382
抗β-Actin兔单克隆抗体BeyotimeAF5003
抗磷酸化NF-κB p65兔单克隆抗体Beyotime--
抗NF-κB p65兔单克隆抗体BeyotimeAF1234
山羊抗兔IgG抗体BeyotimeA0208
山羊抗小鼠IgG抗体BeyotimeA0216
抗磷酸化IĸBa (S32)兔单克隆抗体Cell Signaling Technology14D4
抗IĸBa小鼠单克隆抗体Cell Signaling TechnologyL35A5
总RNA快速提取试剂盒Accurate Biology--
反转录试剂盒Accurate Biology--
Opti-MEM培养基Gibco--
CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒Beyotime--
细胞裂解液Beyotime--
PVDF膜Merck Millipore--
牛血清白蛋白Beyotime--
ECL化学发光试剂Vazyme--
化学发光成像系统0I-X6--
FACSCalibur流式细胞仪BD LSRII--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与病毒增殖
MARC-145细胞培养条件(DMEM+10%FBS+双抗,37℃,5% CO2);PRRSV毒株JXA-1(GenBank EF112445.1)
阅读提示:见Materials and Methods 2.7
FZJDS细胞毒性检测
FZJDS浓度范围0-128 mg/mL,处理时间24-72 h;细胞接种密度2×10^4/孔;CCK-8检测
阅读提示:见Materials and Methods 2.11及Figure 6
抗病毒活性检测
PRRSV感染剂量100 TCID50;FZJDS浓度(文中未明确具体浓度);处理时间24-48 h;检测PRRSV N蛋白和mRNA
阅读提示:见Materials and Methods 2.10和Figure 7
PI3K/Akt通路验证
FZJDS处理时间48 h;检测p-P65、p-JNK、p-IĸBa、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白表达;重复次数(3次独立实验,每次三重复)
阅读提示:见Results 3.6和Figure 8
凋亡检测
FZJDS浓度(文中未明确具体浓度);JNK抑制剂SP600125浓度10 μM;流式细胞术Annexin V/PI双染
阅读提示:见Results 3.7和Figures 9-10