网络药理学预测活性成分和靶点
筛选FZJDS的活性成分并预测其抗PRRSV的潜在靶点。
利用TCMSP、ETCM、HERB数据库筛选FZJDS活性成分,从GeneCards、CTD、OMIM获取PRRSV相关靶点,取交集获得共同靶点,构建PPI网络并筛选核心靶点,进行GO和KEGG富集分析。
Fuzhengjiedu San inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus by activating the PI3K/AKT pathway.
网络药理学预测结合体外细胞实验验证,包括qRT-PCR、Western blot、流式细胞术检测凋亡,但缺乏动物模型等体内验证。
MARC-145细胞 PRRSV JXA-1毒株感染MARC-145细胞模型
MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞) PRRSV JXA-1毒株(GenBank accession no. EF112445.1; lineage 8.7) FZJDS浓度范围(0-128.00 mg/mL)及处理时间(24-72 h) PRRSV感染剂量(100 TCID50) FZJDS抑制PRRSV N蛋白和mRNA表达的检测(qRT-PCR和Western blot)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选FZJDS的活性成分并预测其抗PRRSV的潜在靶点。
利用TCMSP、ETCM、HERB数据库筛选FZJDS活性成分,从GeneCards、CTD、OMIM获取PRRSV相关靶点,取交集获得共同靶点,构建PPI网络并筛选核心靶点,进行GO和KEGG富集分析。
评估FZJDS对MARC-145细胞的毒性,确定安全给药浓度范围。
MARC-145细胞以2×10^4 cells/well接种96孔板,与不同浓度FZJDS孵育24-72 h,CCK-8法检测细胞活力,计算CC50和选择性指数。
验证FZJDS抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制。
MARC-145细胞感染PRRSV(100 TCID50)1 h后,加入不同浓度FZJDS处理24-48 h,采用qRT-PCR和Western blot检测PRRSV N基因mRNA和蛋白表达。
验证FZJDS是否调控PI3K/Akt通路及其下游分子。
MARC-145细胞感染PRRSV(100 TCID50)1 h后,FZJDS处理48 h,Western blot检测P65、p-P65、JNK、p-JNK、IĸBa、p-IĸBa、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白表达。
评估FZJDS对PRRSV诱导细胞凋亡的抑制作用。
PRRSV感染MARC-145细胞后,FZJDS处理48 h,流式细胞术检测凋亡率;使用JNK抑制剂SP600125进一步验证JNK通路在凋亡中的作用。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | BAY 11-7082 | Beyotime | S1523 |
| SP600125 | Beyotime | S1876 | |
| Western blot | 抗PRRSV N蛋白兔多克隆抗体 | Bioss | bs-23941R |
| 抗TLR4兔单克隆抗体 | Bioss | bs-20379R | |
| 抗Bax小鼠单克隆IgG抗体 | Santa Cruz | sc-7480 | |
| 抗JNK1/2(D-9)小鼠单克隆IgG抗体 | Santa Cruz | sc-137019 | |
| 抗磷酸化JNK (G-7)小鼠单克隆IgG抗体 | Santa Cruz | sc-6254 | |
| 抗Bcl-2小鼠单克隆IgG抗体 | Santa Cruz | sc-7382 | |
| 抗β-Actin兔单克隆抗体 | Beyotime | AF5003 | |
| 抗磷酸化NF-κB p65兔单克隆抗体 | Beyotime | -- | |
| 抗NF-κB p65兔单克隆抗体 | Beyotime | AF1234 | |
| 山羊抗兔IgG抗体 | Beyotime | A0208 | |
| 山羊抗小鼠IgG抗体 | Beyotime | A0216 | |
| 抗磷酸化IĸBa (S32)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 14D4 | |
| 抗IĸBa小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | L35A5 | |
| RNA提取 | 总RNA快速提取试剂盒 | Accurate Biology | -- |
| 反转录 | 反转录试剂盒 | Accurate Biology | -- |
| 细胞培养 | Opti-MEM培养基 | Gibco | -- |
| 细胞毒性检测 | CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 蛋白提取 | 细胞裂解液 | Beyotime | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Merck Millipore | -- |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Vazyme | -- | |
| 化学发光成像系统 | 0I-X6 | -- | |
| 流式细胞术 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD LSRII | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒增殖 | MARC-145细胞培养条件(DMEM+10%FBS+双抗,37℃,5% CO2);PRRSV毒株JXA-1(GenBank EF112445.1) 阅读提示:见Materials and Methods 2.7 |
| FZJDS细胞毒性检测 | FZJDS浓度范围0-128 mg/mL,处理时间24-72 h;细胞接种密度2×10^4/孔;CCK-8检测 阅读提示:见Materials and Methods 2.11及Figure 6 |
| 抗病毒活性检测 | PRRSV感染剂量100 TCID50;FZJDS浓度(文中未明确具体浓度);处理时间24-48 h;检测PRRSV N蛋白和mRNA 阅读提示:见Materials and Methods 2.10和Figure 7 |
| PI3K/Akt通路验证 | FZJDS处理时间48 h;检测p-P65、p-JNK、p-IĸBa、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白表达;重复次数(3次独立实验,每次三重复) 阅读提示:见Results 3.6和Figure 8 |
| 凋亡检测 | FZJDS浓度(文中未明确具体浓度);JNK抑制剂SP600125浓度10 μM;流式细胞术Annexin V/PI双染 阅读提示:见Results 3.7和Figures 9-10 |