建立CRF大鼠模型及分组给药
验证腺嘌呤能否诱导CRF肾损伤,并评估MZWT对肾功能的保护作用。
SD大鼠随机分为正常组和模型组,模型组灌胃腺嘌呤150 mg/(kg·d) 4周,之后模型组再分为模型组、MZWT组、苯那普利组,分别继续给予腺嘌呤、腺嘌呤+ MZWT 7.2 g/(kg·d)、腺嘌呤+苯那普利10 mg/(kg·d),持续8周。
Modified Zhenwu Tang delays chronic renal failure progression by modulating oxidative stress and hypoxic responses in renal proximal tubular epithelial cells.
包含体内大鼠模型(腺嘌呤诱导CRF)和体外HK-2细胞模型(缺氧+LPS),结合病理、免疫组化、Western blot、RT-PCR等多层次验证,并包含机制干预(FM19G11、NAC)。
腺嘌呤诱导的CRF大鼠模型 HK-2人肾皮质近端小管上皮细胞
腺嘌呤剂量150 mg/(kg·d)灌胃4周建立CRF模型 MZWT给药剂量7.2 g/(kg·d),持续8周 体外模型:1% O2和2 μg/mL LPS处理HK-2细胞72小时 MZWT含药血清浓度15% HIF-1α抑制剂FM19G11浓度300 nM,抗氧化剂NAC浓度100 μM
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证腺嘌呤能否诱导CRF肾损伤,并评估MZWT对肾功能的保护作用。
SD大鼠随机分为正常组和模型组,模型组灌胃腺嘌呤150 mg/(kg·d) 4周,之后模型组再分为模型组、MZWT组、苯那普利组,分别继续给予腺嘌呤、腺嘌呤+ MZWT 7.2 g/(kg·d)、腺嘌呤+苯那普利10 mg/(kg·d),持续8周。
评估CRF相关代谢紊乱及MZWT的改善作用。
收集24小时尿液,检测尿总蛋白和尿肌酐;检测血清ALT、AST、Cr、BUN、TG、TC、TP、Alb、P、K、Ca水平。
评估肾组织病理损伤和胶原纤维沉积。
肾组织固定、包埋、切片,进行HE染色和Masson染色,显微镜下观察病理变化,Masson染色图像用ImageJ分析。
检测氧化应激、缺氧通路、炎症和纤维化标志物的表达变化。
对肾组织石蜡切片进行免疫组化染色,检测SOD1、MDA、HIF-1α、PHD2、IL-1β、TNF-α、α-SMA和COL1A1的表达,ImageJ分析阳性面积。
验证炎症因子IL-1β和TNF-α在mRNA水平的表达变化。
提取肾组织总RNA,逆转录后使用荧光定量PCR检测IL-1β和TNF-α的mRNA表达,以GAPDH为内参。
模拟体内近端小管上皮细胞的缺氧和氧化应激状态,验证MZWT的细胞保护机制。
HK-2细胞分为正常组、模型组(1% O2 + 2 μg/mL LPS)、空白血清组、药物血清组(15% MZWT含药血清)、FM19G11组(300 nM)、NAC组(100 μM),处理72小时。
评估MZWT对缺氧+LPS诱导的细胞凋亡和氧化应激的影响。
使用TUNEL染色检测细胞凋亡,流式细胞术使用ROS检测试剂盒测定细胞内ROS水平。
评估MZWT对细胞氧化应激水平和炎症因子释放的影响。
收集细胞上清,检测GSH、SOD、MDA水平;使用ELISA试剂盒检测IL-1β和TNF-α水平。
检测α-SMA和COL1A1的表达变化,评估EMT和纤维化程度。
对肾组织和HK-2细胞进行免疫荧光染色,检测α-SMA和COL1A1表达,ImageJ分析荧光强度。
验证氧化应激、HIF通路和纤维化相关蛋白的表达水平。
提取肾组织和细胞蛋白,BCA法测定浓度,SDS-PAGE电泳,转膜,抗体孵育,显色曝光,使用AIWBwellTM分析软件分析。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 腺嘌呤 | -- | -- |
| 盐酸贝那普利 | 上海新亚药业闵行有限公司 | H20044840 | |
| 细胞实验 | FM19G11 | Glpbio | GC50537 |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | C8460 | |
| 脂多糖 | Sigma | L8880 | |
| 细胞培养 | MEM培养基 | -- | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 免疫组化 | SOD1抗体 | Proteintech | 10269-1-AP |
| MDA抗体 | 北京博奥森生物技术有限公司 | bs-23343R | |
| IL-1β抗体 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | PB0981 | |
| TNF-α抗体 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | GB11188 | |
| PHD2抗体 | Proteintech | 19886-1-AP | |
| HIF-1α抗体 | 北京博奥森生物技术有限公司 | bs-20399R | |
| α-SMA抗体 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | GB11347 | |
| COL1A1抗体 | 武汉博士德生物工程有限公司 | PB0981 | |
| Western blot | HIF-1α抗体 | CST | 36169 |
| PHD2抗体 | CST | 4835 | |
| SDS-PAGE凝胶 | GenScript | -- | |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | Vazyme | 037E2251HA |
| 流式细胞术 | ROS检测试剂盒 | -- | -- |
| 氧化/抗氧化检测 | GSH检测试剂盒 | 南京建成 | A006-2-1 |
| SOD检测试剂盒 | 南京建成 | A001-3-1 | |
| MDA检测试剂盒 | 南京建成 | A003-1 | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Lianke Biotech | EK301B-01 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Thermo Fisher | 88-7340 | |
| RT-qPCR | Servicebio®反转录第一链cDNA合成试剂盒 | Servicebio | G3330 |
| TRIzol试剂 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10006818 | |
| 尿液分析 | 尿总蛋白试剂 | 石家庄长江生物技术开发有限公司 | 220526 |
| 肌酐试剂盒 | 贝克曼库尔特实验系统有限公司 | AUZ3562 | |
| 生化分析 | 生化试剂盒 | 贝克曼库尔特实验系统有限公司 | AUZ3689, AUZ3645, AUZ3562, AUZ3611, AUZ3592, AUZ3625 |
| TP和Alb试剂盒 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 200941, 200923 | |
| P、K、Ca试剂盒 | 长春汇力生物技术有限公司 | B008, K060, K063 | |
| 尿液分析 | 尿液分析仪 | CLINITEK50 | -- |
| 生化分析 | 全自动生化分析仪 | Sysmex HEMIX-180 | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Olympus BX53 | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | BECKMAN CytoFLEX | -- |
| 免疫荧光 | 荧光显微镜 | NIKON ECLIPSE C1 | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 腺嘌呤剂量、给药途径、造模周期、分组 阅读提示:Materials and methods 2.1 和 2.2 |
| 药物治疗 | MZWT剂量、苯那普利剂量、给药周期 阅读提示:Materials and methods 2.2 |
| 细胞处理 | HK-2细胞培养条件、缺氧浓度、LPS浓度、处理时间、含药血清浓度 阅读提示:Materials and methods 2.9 和 2.10 |
| 分子检测 | 抗体稀释比、PCR引物序列、转膜条件 阅读提示:Materials and methods 2.7, 2.8, 2.16 |