加味真武汤通过调节肾近端小管上皮细胞的氧化应激和缺氧反应延缓慢性肾功能衰竭进展

Modified Zhenwu Tang delays chronic renal failure progression by modulating oxidative stress and hypoxic responses in renal proximal tubular epithelial cells.

作者信息Yuan-Yuan Zhang, Pei-Pei Jin, Deng-Zhou Guo, Dong Bian
PMID38803876
期刊Heliyon
发布时间2024-05-15
DOI10.1016/j.heliyon.2024.e31265

实验完整度

包含体内大鼠模型(腺嘌呤诱导CRF)和体外HK-2细胞模型(缺氧+LPS),结合病理、免疫组化、Western blot、RT-PCR等多层次验证,并包含机制干预(FM19G11、NAC)。

主要模型

腺嘌呤诱导的CRF大鼠模型 HK-2人肾皮质近端小管上皮细胞

重点核对

腺嘌呤剂量150 mg/(kg·d)灌胃4周建立CRF模型 MZWT给药剂量7.2 g/(kg·d),持续8周 体外模型:1% O2和2 μg/mL LPS处理HK-2细胞72小时 MZWT含药血清浓度15% HIF-1α抑制剂FM19G11浓度300 nM,抗氧化剂NAC浓度100 μM

摘要

背景:肾小管间质纤维化(TIF)是慢性肾功能衰竭(CRF)的关键病理特征,肾近端小管上皮细胞中的氧化应激(OS)和缺氧反应在疾病进展中起关键作用。本研究探讨加味真武汤(MZWT)对这些过程的影响,旨在揭示其延缓CRF进展的潜在机制。方法:我们使用腺嘌呤(Ade)诱导大鼠CRF,然后用苯那普利盐酸盐(洛汀新)和MZWT治疗8周。评估包括肝肾功能、电解质、血脂、肾组织病理、OS水平、缺氧诱导因子(HIF)通路、炎症标志物及其他相关指标。体外,人肾皮质近端小管上皮细胞经受缺氧和脂多糖处理72小时,同时使用MZWT、FM19G11和N-乙酰-L-半胱氨酸治疗。测量包括活性氧(ROS)、HIF通路活性、炎症标志物及其他相关指标。结果:Ade治疗诱导大鼠肾功能、血脂、电解质和肾小管间质结构的显著紊乱,同时伴随OS、HIF通路激活和炎症反应的增强。体内,MZWT有效改善蛋白尿、肾功能障碍、脂质和电解质失衡以及肾组织损伤;它还抑制OS、HIF通路激活、近端小管上皮细胞的上皮间质转化(EMT),并减少炎症细胞因子和胶原纤维的产生。体外研究结果表明,MZWT减少凋亡,降低ROS产生,抑制近端小管上皮细胞的OS、HIF通路激活和EMT,并减少炎症细胞因子和胶原的输出。结论:OS和缺氧反应显著促进TIF的发展。MZWT减轻肾近端小管上皮细胞中的这些反应,从而延缓CRF的进展。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
肾近端小管上皮细胞的氧化应激和缺氧反应是否参与肾小管间质纤维化(TIF)的发生,以及加味真武汤(MZWT)是否通过调节这些反应延缓慢性肾功能衰竭(CRF)的进展。
核心机制
MZWT通过抑制肾近端小管上皮细胞的氧化应激和HIF通路激活,减少炎症因子释放、上皮间质转化和细胞凋亡,从而减轻肾小管间质纤维化。
主要证据
体内实验显示MZWT降低模型大鼠肾组织中MDA、HIF-1α、α-SMA、IL-1β、TNF-α表达,升高SOD1和PHD2表达;体外实验显示MZWT减少缺氧+LPS处理的HK-2细胞凋亡、ROS产生、HIF-1α表达,并增加PHD2表达。
研究意义
为CRF的临床治疗提供了新策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立CRF大鼠模型及分组给药

验证腺嘌呤能否诱导CRF肾损伤,并评估MZWT对肾功能的保护作用。

SD大鼠随机分为正常组和模型组,模型组灌胃腺嘌呤150 mg/(kg·d) 4周,之后模型组再分为模型组、MZWT组、苯那普利组,分别继续给予腺嘌呤、腺嘌呤+ MZWT 7.2 g/(kg·d)、腺嘌呤+苯那普利10 mg/(kg·d),持续8周。

2

检测肾功能、血脂、电解质和尿液指标

评估CRF相关代谢紊乱及MZWT的改善作用。

收集24小时尿液,检测尿总蛋白和尿肌酐;检测血清ALT、AST、Cr、BUN、TG、TC、TP、Alb、P、K、Ca水平。

3

肾组织病理染色

评估肾组织病理损伤和胶原纤维沉积。

肾组织固定、包埋、切片,进行HE染色和Masson染色,显微镜下观察病理变化,Masson染色图像用ImageJ分析。

4

免疫组化检测肾组织蛋白表达

检测氧化应激、缺氧通路、炎症和纤维化标志物的表达变化。

对肾组织石蜡切片进行免疫组化染色,检测SOD1、MDA、HIF-1α、PHD2、IL-1β、TNF-α、α-SMA和COL1A1的表达,ImageJ分析阳性面积。

5

RT-PCR检测肾组织炎症因子mRNA

验证炎症因子IL-1β和TNF-α在mRNA水平的表达变化。

提取肾组织总RNA,逆转录后使用荧光定量PCR检测IL-1β和TNF-α的mRNA表达,以GAPDH为内参。

6

体外HK-2细胞模型建立与药物干预

模拟体内近端小管上皮细胞的缺氧和氧化应激状态,验证MZWT的细胞保护机制。

HK-2细胞分为正常组、模型组(1% O2 + 2 μg/mL LPS)、空白血清组、药物血清组(15% MZWT含药血清)、FM19G11组(300 nM)、NAC组(100 μM),处理72小时。

7

检测细胞凋亡和ROS水平

评估MZWT对缺氧+LPS诱导的细胞凋亡和氧化应激的影响。

使用TUNEL染色检测细胞凋亡,流式细胞术使用ROS检测试剂盒测定细胞内ROS水平。

8

检测细胞上清氧化/抗氧化指标和炎症因子

评估MZWT对细胞氧化应激水平和炎症因子释放的影响。

收集细胞上清,检测GSH、SOD、MDA水平;使用ELISA试剂盒检测IL-1β和TNF-α水平。

9

免疫荧光检测纤维化标志物

检测α-SMA和COL1A1的表达变化,评估EMT和纤维化程度。

对肾组织和HK-2细胞进行免疫荧光染色,检测α-SMA和COL1A1表达,ImageJ分析荧光强度。

10

Western blot检测蛋白表达

验证氧化应激、HIF通路和纤维化相关蛋白的表达水平。

提取肾组织和细胞蛋白,BCA法测定浓度,SDS-PAGE电泳,转膜,抗体孵育,显色曝光,使用AIWBwellTM分析软件分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
腺嘌呤----
盐酸贝那普利上海新亚药业闵行有限公司H20044840
FM19G11GlpbioGC50537
N-乙酰-L-半胱氨酸SigmaC8460
脂多糖SigmaL8880
MEM培养基----
PVDF膜----
SOD1抗体Proteintech10269-1-AP
MDA抗体北京博奥森生物技术有限公司bs-23343R
IL-1β抗体武汉赛维尔生物科技有限公司PB0981
TNF-α抗体武汉赛维尔生物科技有限公司GB11188
PHD2抗体Proteintech19886-1-AP
HIF-1α抗体北京博奥森生物技术有限公司bs-20399R
α-SMA抗体武汉赛维尔生物科技有限公司GB11347
COL1A1抗体武汉博士德生物工程有限公司PB0981
HIF-1α抗体CST36169
PHD2抗体CST4835
SDS-PAGE凝胶GenScript--
TUNEL凋亡检测试剂盒Vazyme037E2251HA
ROS检测试剂盒----
GSH检测试剂盒南京建成A006-2-1
SOD检测试剂盒南京建成A001-3-1
MDA检测试剂盒南京建成A003-1
IL-1β ELISA试剂盒Lianke BiotechEK301B-01
TNF-α ELISA试剂盒Thermo Fisher88-7340
Servicebio®反转录第一链cDNA合成试剂盒ServicebioG3330
TRIzol试剂国药集团化学试剂有限公司10006818
尿总蛋白试剂石家庄长江生物技术开发有限公司220526
肌酐试剂盒贝克曼库尔特实验系统有限公司AUZ3562
生化试剂盒贝克曼库尔特实验系统有限公司AUZ3689, AUZ3645, AUZ3562, AUZ3611, AUZ3592, AUZ3625
TP和Alb试剂盒中生北控生物科技股份有限公司200941, 200923
P、K、Ca试剂盒长春汇力生物技术有限公司B008, K060, K063
尿液分析仪CLINITEK50--
全自动生化分析仪Sysmex HEMIX-180--
荧光显微镜Olympus BX53--
流式细胞仪BECKMAN CytoFLEX--
荧光显微镜NIKON ECLIPSE C1--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
腺嘌呤剂量、给药途径、造模周期、分组
阅读提示:Materials and methods 2.1 和 2.2
药物治疗
MZWT剂量、苯那普利剂量、给药周期
阅读提示:Materials and methods 2.2
细胞处理
HK-2细胞培养条件、缺氧浓度、LPS浓度、处理时间、含药血清浓度
阅读提示:Materials and methods 2.9 和 2.10
分子检测
抗体稀释比、PCR引物序列、转膜条件
阅读提示:Materials and methods 2.7, 2.8, 2.16