转录组测序筛选差异miRNA
鉴定与猪背最长肌发育相关的候选miRNA
对1、90、180日龄晋汾白猪背最长肌进行miRNA-seq，筛选差异表达miRNA，并通过GO/KEGG富集分析预测其功能。
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LncRNA LOC106505926对猪原代细胞肌生成和脂质生成的影响
Effect of LncRNA LOC106505926 on myogenesis and Lipogenesis of porcine primary cells.
实验完整度
高研究包含转录组测序筛选、细胞功能实验（增殖分化）、双荧光素酶报告验证、RNA pull-down及Western blot等验证，覆盖分子机制和功能验证，证据层级丰富。
主要模型
猪骨骼肌卫星细胞（PSCs） 猪前脂肪细胞 晋汾白猪背最长肌组织
重点核对
miR-22-5p mimic/inhibitor转染浓度（50 nM）及转染时间（48 h） PSCs分离自3日龄晋汾白猪，培养于Matrigel包被培养皿，分化培养基含5%马血清 前脂肪细胞诱导分化条件：地塞米松（1 µmol/L）、吲哚美辛（100 µmol/L）、IBMX（0.5 mmol/L）、胰岛素（10 µg/mL） 双荧光素酶报告基因检测中，miR-22-5p mimics与CXXC5-wt-psiCHECK2或LOC106505926-wt-psiCHECK2共转染HEK-293T细胞后检测荧光活性
摘要
背景
骨骼肌发育和脂肪沉积对肉品质有重要影响。研究调控骨骼肌发育和脂肪沉积对提高胴体和肉品质具有重要意义。在本研究中，对晋汾白猪1、90和180日龄的背最长肌进行了全转录组测序（包括RNA-Seq和miRNA-Seq）。
结果
结果显示，在任意两组比较中共筛选出245个差异表达miRNA，这些miRNA可能参与肌生成的调控。其中，与1日龄组相比，miR-22-5p在90日龄组和180日龄组中显著上调。功能研究表明，miR-22-5p抑制猪骨骼肌卫星细胞（PSCs）的增殖和分化。Pearson相关系数分析显示，长链非编码RNA（lncRNA）LOC106505926和CXXC5基因与miR-22-5p存在强负相关。LOC106505926和CXXC5被证明能促进PSCs的增殖和分化，与miR-22-5p的作用相反。在机制上，LOC106505926作为miR-22-5p的分子海绵调节CXXC5的表达，从而抑制PSCs的分化。此外，LOC106505926通过直接与FASN结合调控猪前脂肪细胞的分化。
结论
总之，我们的结果强调了LOC106505926在控制猪骨骼肌和脂肪组织发育中的多方面调节作用，并为通过调节骨骼肌发育和脂肪沉积来改善畜产品质量提供了新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LOC106505926和miR-22-5p如何调控猪骨骼肌卫星细胞增殖分化及前脂肪细胞分化？
- 核心机制
- LOC106505926作为miR-22-5p的分子海绵，解除miR-22-5p对CXXC5的抑制作用，从而促进PSCs增殖分化；在前脂肪细胞中，LOC106505926直接与FASN结合抑制脂肪分化。
- 主要证据
- PSCs增殖分化实验（EdU、流式细胞术、免疫荧光、Western blot）、双荧光素酶报告基因验证miR-22-5p与CXXC5/LOC106505926结合、RNA pull-down和质谱鉴定LOC106505926与FASN互作。
- 研究意义
- 揭示LOC106505926在调控猪骨骼肌和脂肪组织发育中的多功能作用，为通过调节骨骼肌发育和脂肪沉积改善畜产品质量提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证miR-22-5p对PSCs增殖和分化的影响
验证miR-22-5p对PSCs功能的作用
在PSCs中转染miR-22-5p mimic或inhibitor，检测增殖标志基因、EdU阳性细胞数、分化标志基因表达及肌管形成。
鉴定miR-22-5p靶基因和lncRNA
确定miR-22-5p的直接结合靶标
通过Pearson相关性分析、RNAhybrid预测及双荧光素酶报告基因实验验证miR-22-5p与CXXC5和LOC106505926的3'UTR结合。
研究LOC106505926和CXXC5对PSCs功能的作用
验证LOC106505926和CXXC5对PSCs增殖和分化的促进作用
分别过表达或敲低LOC106505926和CXXC5，检测增殖标志基因、EdU、cell cycle、分化标志基因及肌管形成。
救援实验验证ceRNA机制
验证LOC106505926/miR-22-5p/CXXC5调控轴的因果关系
在PSCs中共转染miR-22-5p mimic与OE-CXXC5或OE-LOC106505926，检测PCNA和MYOD蛋白表达变化。
研究LOC106505926对前脂肪细胞分化的影响及互作蛋白鉴定
验证LOC106505926对前脂肪细胞分化的抑制作用并鉴定其直接结合蛋白
在前脂肪细胞中敲低LOC106505926，诱导脂肪分化，检测脂滴形成和成脂标志基因表达；通过RNA pull-down和质谱鉴定互作蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNAiso Plus | Takara | -- |
| cDNA合成（mRNA） | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| qRT-PCR | SYBR Premix Ex Taq II | Takara | -- |
| miRNA cDNA合成 | miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- |
| miRNA qRT-PCR | miRNA通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | MQ101 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 人重组碱性成纤维细胞生长因子 | Gibco | -- | |
| 马血清 | HyClone | -- | |
| 细胞转染 | Lipo3000 | Invitrogen | -- |
| psPAX2 | Public Protein/Plasmid Library | -- | |
| pMD2G | Public Protein/Plasmid Library | -- | |
| EdU实验 | Apollo染色反应液 | Ribobio | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 酶标仪 | BioTek | -- |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | Sanofi-Aventis | -- |
| 油红O染色 | 油红O染液 | Solarbio | -- |
| RNA pull-down | 生物素标记的LOC106505926探针 | RiboBio | -- |
| Western blot一抗（MYOG） | MYOG抗体 | Abclonal | -- |
| Western blot一抗（MYOD） | MYOD抗体 | Proteintech | -- |
| Western blot一抗（CXXC5） | CXXC5抗体 | Bioss | -- |
| Western blot一抗（MHC） | MHC抗体 | DSHB | -- |
| Western blot一抗（FABP4） | FABP4抗体 | Proteintech | -- |
| Western blot一抗（PPARγ） | PPARγ抗体 | Proteintech | -- |
| Western blot一抗（SREBP1） | SREBP1抗体 | Proteintech | -- |
| Western blot一抗（FASN） | FASN抗体 | Proteintech | -- |
| Western blot二抗 | 山羊抗小鼠IgG | Servicebio | -- |
| 山羊抗兔IgG | Servicebio | -- | |
| Western blot内参 | GAPDH抗体 | Servicebio | -- |
| 免疫荧光二抗 | 山羊抗小鼠IgG抗体 | Bioss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物样本 | 晋汾白猪（去势公猪）每年龄3头，1、90、180日龄，背最长肌采集 阅读提示：Methods: Experimental animals and samples |
| 细胞分离与培养 | PSCs分离自3日龄猪，消化液（DMEM含15%胶原酶II, 15%分散酶II, 1%青链霉素），培养于Matrigel包被培养皿，生长培养基含20% FBS, 2.5 ng/mL bFGF 阅读提示：Methods: PSCs isolation, culture and differentiation |
| 细胞转染 | 转染试剂Lipo3000，RNA oligo浓度50 nM，细胞密度约60%，转染后48 h检测 阅读提示：Methods: Cell transfection |
| qRT-PCR | 内参：18sRNA（mRNA）和U6 snRNA（miRNA）；反应程序：95°C 30s; 95°C 5s, 58°C 30s, 35 cycles（mRNA）；miRNA程序：95°C 5min, 40 cycles 95°C 10s, 60°C 30s, 72°C 8s 阅读提示：Methods: Total RNA extraction and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) |
| 前脂肪细胞诱导分化 | 诱导培养基：DMEM含10% FBS, 1%青链霉素，地塞米松1 µmol/L, 吲哚美辛100 µmol/L, IBMX 0.5 mmol/L, 胰岛素10 µg/mL；4天后换维持培养基（含胰岛素10 µg/mL） 阅读提示：Methods: Porcine preadipocytes isolation, culture and differentiation |
| 双荧光素酶报告基因 | HEK-293T细胞共转染miRNA mimic/抑制剂与CXXC5/LOC106505926野生型或突变型psiCHECK2载体，24 h后检测 阅读提示：Methods: Dual-luciferase reporter assay |
| RNA pull-down | 生物素标记的LOC106505926探针，50 pmol，与细胞裂解液孵育，链霉亲和素磁珠捕获，洗脱后质谱分析 阅读提示：Methods: RNA pull-down assay |
| 统计分析 | 多组比较用单因素方差分析，两组比较用双尾t检验，P<0.05为显著，P<0.01为极显著 阅读提示：Methods: Statistical analysis |