产热激活脂肪组织中免疫细胞亚群的动态变化

Dynamic changes of immunocyte subpopulations in thermogenic activation of adipose tissues.

作者信息Yuqing Ye, Huiying Wang, Wei Chen, Zhinan Chen, Dan Wu, Feng Zhang, Fang Hu
PMID38812501
发布时间2024-05-15
DOI10.3389/fimmu.2024.1375138

实验完整度

中

包含生物信息学分析(Cibersort、mMCP-counter)、scRNA-seq重分析、流式细胞术、免疫荧光和RT-qPCR等多层次验证,但对免疫细胞功能的直接验证不足。

主要模型

C57BL/6J小鼠 棕色脂肪组织(BAT) 皮下白色脂肪组织(SAT)

重点核对

冷暴露时间点:RT, 1d, 3d, 7d 冷暴露温度:4°C 小鼠性别和年龄:雄性,8-10周龄 样本量:每组n=4-6 UCP1表达验证冷暴露效果

摘要

目的:冷暴露对人类全身代谢的影响日益受到关注。棕色或米色脂肪组织在冷诱导产热过程中对能量消耗至关重要,因此具有对抗代谢紊乱的潜力。尽管产热脂肪组织存在免疫调节,但在不同寒冷时期关键免疫细胞的整体变化仍不清楚。本研究旨在探讨不同冷暴露时期免疫细胞的整体变化,并筛选几种可能参与产热调节的免疫细胞亚群。方法:采用Cibersort和mMCP-counter算法分析不同寒冷时期两种产热脂肪组织(棕色和米色)的免疫浸润。通过重新分析单细胞测序数据集(GSE207706)验证了一些关键免疫细胞群的变化。采用流式细胞术、免疫荧光和实时定量PCR检测冷刺激下小鼠产热脂肪组织中免疫细胞的比例或表达变化。结果:在棕色脂肪组织中,冷暴露下单核细胞、初始T细胞和记忆T细胞的比例增加,而NK细胞的比例降低。结论:我们的研究揭示了产热脂肪组织中免疫细胞谱的动态变化,并鉴定了几个新的免疫细胞亚群,这些亚群可能有助于冷暴露下脂肪组织的产热激活。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
冷暴露不同时期,产热脂肪组织(BAT和SAT)中免疫细胞亚群如何动态变化?
核心机制
冷暴露诱导BAT中单核细胞、初始和记忆T细胞比例增加,NK细胞比例降低,提示这些免疫细胞可能参与产热调节。
主要证据
利用GEO数据集进行Cibersort和mMCP-counter分析,结合scRNA-seq(GSE207706)和实验验证(流式、免疫荧光、RT-qPCR),证实BAT中单核细胞、初始和记忆T细胞增加,NK细胞减少。
研究意义
本研究为产热脂肪组织中的免疫调节提供了新见解,为未来研究免疫细胞在产热中的作用奠定基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

数据收集与预处理

获取冷暴露不同时期的BAT和SAT转录组数据

从GEO数据库下载BAT和SAT的RNA测序数据,包括不同冷暴露时间点(6h至35d)的数据集。

2

免疫浸润分析

评估冷暴露下免疫细胞和基质细胞的变化

使用Cibersort和mMCP-counter算法分析BAT和SAT中免疫细胞的浸润比例或丰度。

3

单细胞RNA测序数据重分析

验证bulk RNA测序结果

重新分析GSE207706数据集,鉴定BAT中细胞亚群变化。

4

动物实验与样本收集

验证免疫细胞变化并评估冷暴露模型

将雄性C57BL/6J小鼠(8-10周)置于4°C或室温(RT)1天、3天、7天,收集BAT和SAT的SVF。

5

流式细胞术验证

检测免疫细胞亚群的比例变化

使用流式细胞术分析SVF中单核细胞、NK细胞、T细胞亚群、巨噬细胞和内皮细胞的比例。

6

免疫荧光验证

验证免疫细胞与内皮细胞/交感神经的共定位

通过免疫荧光检测BAT中NK1.1+ NK细胞、CD11B+CD115+单核细胞与CD31+内皮细胞或TH+交感神经元的共定位。

7

RT-qPCR验证

检测mRNA表达变化

从SVF中提取RNA,检测Ucp1, NK1.1, CD31等基因的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

免疫浸润分析
单细胞转录组分析

产品清单

实验环节名称品牌货号
II型胶原酶----
红细胞裂解液----
Magzol试剂MagenR4801-01
逆转录试剂盒Accurate BiologyAG11728
实时PCR混合物Yeason11202ES03
zombie-APC-Cy7染料Biolegend423105
细胞染色缓冲液BD Pharmingen554657
FcX封闭液Biolegend156604
CD45-PE抗体Biolegend147711
Ly6C-AF488抗体Biolegend128021
Ly6G-BV510抗体Biolegend127633
CD11B-Pacific blue抗体Biolegend101223
CD45-PerCP-Cyanine5.5抗体Biolegend103131
F4/80-PE/Cy7抗体Biolegend123114
CD206-PE抗体Biolegend141705
CD11C-Percp抗体Biolegend117325
CD3-APC抗体Biolegend100235
NK1.1-PE/Cy7抗体Biolegend156513
CD31-APC抗体Biolegend102409
CD3-FITC抗体Biolegend100203
CD4-Pacific blue抗体Biolegend100427
CD8-AF700抗体Biolegend100729
CD62L-APC-Cy7抗体Biolegend104427
碘化丙啶溶液-PEBiolegend421301
流式细胞仪Cytek Northern Lights 3000 and Agilent Novocyte Advanteon--
HRP结合的抗兔二抗ServicebioGB23303
Alexa Fluor 488结合的抗兔二抗ServicebioGB25303
CD44一抗ServicebioGB112054
CD62L一抗Biossbs-1036R
CD31一抗ServicebioGB113151
TH一抗ServicebioGB11181
CD11B一抗ServicebioGB11058
CD115一抗ServicebioGB11581
NK1.1一抗AbcamAB289542
GraphPad Prism软件GraphPad10.1.1

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
小鼠品系、性别、年龄、冷暴露温度和时长、室温对照
阅读提示:Methods 2.4 Animal procedures
冷暴露处理
冷暴露时间点(1d、3d、7d)
阅读提示:Methods 2.4 Animal procedures; 图例图5A
流式细胞术
抗体克隆号、稀释比例、样本制备、门控策略
阅读提示:Methods 2.6 Flow cytometry
RT-qPCR
引物序列、内参基因、PCR条件
阅读提示:Methods 2.5 RT-qPCR; Table S1
免疫荧光
一抗和二抗的稀释比例、孵育时间、封片条件
阅读提示:Methods 2.7 Immunofluorescence assay