数据收集与预处理
获取冷暴露不同时期的BAT和SAT转录组数据
从GEO数据库下载BAT和SAT的RNA测序数据,包括不同冷暴露时间点(6h至35d)的数据集。
Dynamic changes of immunocyte subpopulations in thermogenic activation of adipose tissues.
包含生物信息学分析(Cibersort、mMCP-counter)、scRNA-seq重分析、流式细胞术、免疫荧光和RT-qPCR等多层次验证,但对免疫细胞功能的直接验证不足。
C57BL/6J小鼠 棕色脂肪组织(BAT) 皮下白色脂肪组织(SAT)
冷暴露时间点:RT, 1d, 3d, 7d 冷暴露温度:4°C 小鼠性别和年龄:雄性,8-10周龄 样本量:每组n=4-6 UCP1表达验证冷暴露效果
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取冷暴露不同时期的BAT和SAT转录组数据
从GEO数据库下载BAT和SAT的RNA测序数据,包括不同冷暴露时间点(6h至35d)的数据集。
评估冷暴露下免疫细胞和基质细胞的变化
使用Cibersort和mMCP-counter算法分析BAT和SAT中免疫细胞的浸润比例或丰度。
验证bulk RNA测序结果
重新分析GSE207706数据集,鉴定BAT中细胞亚群变化。
验证免疫细胞变化并评估冷暴露模型
将雄性C57BL/6J小鼠(8-10周)置于4°C或室温(RT)1天、3天、7天,收集BAT和SAT的SVF。
检测免疫细胞亚群的比例变化
使用流式细胞术分析SVF中单核细胞、NK细胞、T细胞亚群、巨噬细胞和内皮细胞的比例。
验证免疫细胞与内皮细胞/交感神经的共定位
通过免疫荧光检测BAT中NK1.1+ NK细胞、CD11B+CD115+单核细胞与CD31+内皮细胞或TH+交感神经元的共定位。
检测mRNA表达变化
从SVF中提取RNA,检测Ucp1, NK1.1, CD31等基因的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | II型胶原酶 | -- | -- |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | -- | -- |
| RNA提取 | Magzol试剂 | Magen | R4801-01 |
| 逆转录 | 逆转录试剂盒 | Accurate Biology | AG11728 |
| qPCR | 实时PCR混合物 | Yeason | 11202ES03 |
| 流式细胞术 | zombie-APC-Cy7染料 | Biolegend | 423105 |
| 细胞染色缓冲液 | BD Pharmingen | 554657 | |
| FcX封闭液 | Biolegend | 156604 | |
| CD45-PE抗体 | Biolegend | 147711 | |
| Ly6C-AF488抗体 | Biolegend | 128021 | |
| Ly6G-BV510抗体 | Biolegend | 127633 | |
| CD11B-Pacific blue抗体 | Biolegend | 101223 | |
| CD45-PerCP-Cyanine5.5抗体 | Biolegend | 103131 | |
| F4/80-PE/Cy7抗体 | Biolegend | 123114 | |
| CD206-PE抗体 | Biolegend | 141705 | |
| CD11C-Percp抗体 | Biolegend | 117325 | |
| CD3-APC抗体 | Biolegend | 100235 | |
| NK1.1-PE/Cy7抗体 | Biolegend | 156513 | |
| CD31-APC抗体 | Biolegend | 102409 | |
| CD3-FITC抗体 | Biolegend | 100203 | |
| CD4-Pacific blue抗体 | Biolegend | 100427 | |
| CD8-AF700抗体 | Biolegend | 100729 | |
| CD62L-APC-Cy7抗体 | Biolegend | 104427 | |
| 碘化丙啶溶液-PE | Biolegend | 421301 | |
| 流式细胞仪 | Cytek Northern Lights 3000 and Agilent Novocyte Advanteon | -- | |
| 免疫荧光 | HRP结合的抗兔二抗 | Servicebio | GB23303 |
| Alexa Fluor 488结合的抗兔二抗 | Servicebio | GB25303 | |
| CD44一抗 | Servicebio | GB112054 | |
| CD62L一抗 | Bioss | bs-1036R | |
| CD31一抗 | Servicebio | GB113151 | |
| TH一抗 | Servicebio | GB11181 | |
| CD11B一抗 | Servicebio | GB11058 | |
| CD115一抗 | Servicebio | GB11581 | |
| NK1.1一抗 | Abcam | AB289542 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad | 10.1.1 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、冷暴露温度和时长、室温对照 阅读提示:Methods 2.4 Animal procedures |
| 冷暴露处理 | 冷暴露时间点(1d、3d、7d) 阅读提示:Methods 2.4 Animal procedures; 图例图5A |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、稀释比例、样本制备、门控策略 阅读提示:Methods 2.6 Flow cytometry |
| RT-qPCR | 引物序列、内参基因、PCR条件 阅读提示:Methods 2.5 RT-qPCR; Table S1 |
| 免疫荧光 | 一抗和二抗的稀释比例、孵育时间、封片条件 阅读提示:Methods 2.7 Immunofluorescence assay |