空间多组学分析
探索OSCC肿瘤内部代谢异质性，识别肿瘤边缘的特异性代谢特征和关键基因
使用AFADESI-MSI进行空间代谢组学分析，使用DSP进行空间转录组分析，比较肿瘤中心、边缘和正常组织的代谢物和基因表达
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由RRAD介导的肿瘤边缘增强的能量代谢促进口腔鳞状细胞癌的进展
The enhanced energy metabolism in the tumor margin mediated by RRAD promotes the progression of oral squamous cell carcinoma.
实验完整度
高包含空间代谢组学、空间转录组、体外细胞功能实验、体内异种移植模型和临床样本验证等多层级证据，并验证了CAMKIV-CREB1-GLUT3机制链路。
主要模型
CAL27细胞系 HN4细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 OSCC患者组织样本
重点核对
RRAD在OSCC组织中的表达与淋巴结转移及预后相关性 RRAD沉默对细胞葡萄糖摄取、乳酸产生和ADP:ATP比等能量代谢指标的影响 RRAD沉默后CAMKIV-CREB1轴的激活及GLUT3上调 GLUT inhibitor-1对RRAD沉默引起的恶性表型的抑制作用
摘要
肿瘤边缘作为侵袭前沿已被证明与口腔鳞状细胞癌（OSCC）的进展和转移密切相关。然而，边缘区域的肿瘤细胞如何获得肿瘤进展所需的额外能量仍然未知。在这里，我们使用空间代谢组学和空间转录组学来识别OSCC肿瘤边缘能量代谢的增强，并确定肿瘤细胞中Ras相关的糖酵解抑制剂和钙通道调节因子（RRAD）的下调介导了这一过程。RRAD的缺失增强了体内外肿瘤细胞的葡萄糖摄取和恶性行为。机制上，RRAD的下调促进了Ca2+的内流并提高了其在细胞核中的浓度，导致CAMKIV-CREB1轴的激活，从而诱导葡萄糖转运蛋白GLUT3的转录。GLUT抑制剂-1作为GLUT3的抑制剂，可以抑制由RRAD下调引起的这种旺盛的能量代谢和恶性行为。总之，我们的研究揭示了由RRAD介导的肿瘤边缘增强的能量代谢促进OSCC的进展，并证明GLUT3是未来治疗OSCC的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤边缘的OSCC细胞如何获得额外的能量以支持侵袭和进展，涉及哪些关键分子机制？
- 核心机制
- RRAD下调导致细胞内和核内Ca2+浓度升高，激活CAMKIV-CREB1轴，进而上调GLUT3，增强葡萄糖摄取和能量代谢，促进肿瘤进展。
- 主要证据
- 空间代谢组学和空间转录组学显示肿瘤边缘能量代谢增强，体外实验中RRAD沉默增强能量代谢和恶性行为，体内异种移植模型证实RRAD敲低促进肿瘤生长，机制上GLUT3上调，GLUT inhibitor-1可逆转这些效应。
- 研究意义
- 研究首次揭示RRAD通过Ca2+-CAMKIV-CREB1-GLUT3轴连接Ca2+信号与代谢重编程，提供GLUT3作为OSCC治疗潜在靶点的证据，并提示口服葡萄糖代谢抑制剂可能成为治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RRAD表达与临床相关性分析
验证RRAD在OSCC中的表达水平及其与临床预后的关系
通过RT-PCR检测OSCC细胞系和正常口腔黏膜中RRAD mRNA水平，IHC检测OSCC组织中RRAD蛋白表达，TCGA数据分析生存和表达
RRAD功能缺失的体外实验
评估RRAD沉默对OSCC细胞能量代谢和恶性行为的影响
使用siRNA沉默RRAD，检测Ca2+浓度、葡萄糖摄取、乳酸产生、ADP:ATP比率、ECAR、迁移、侵袭、增殖
RNA测序及下游靶点鉴定
确定RRAD沉默后导致能量代谢增强的关键下游分子
RNA-seq分析RRAD沉默后的差异表达基因，GO富集分析，验证GLUTs家族表达
机制验证：核Ca2+-CAMKIV-CREB1-GLUT3通路
阐明RRAD下调上调GLUT3的具体分子机制
检测核内Ca2+浓度，CAMKIV和CREB1的磷酸化，ChIP验证CREB1结合GLUT3启动子，敲低CAMKIV验证对GLUT3表达的影响
GLUT inhibitor-1体外实验
验证抑制GLUT3能否逆转RRAD沉默引起的代谢增强和恶性表型
使用GLUT inhibitor-1处理RRAD沉默的细胞，检测葡萄糖摄取、ADP:ATP比率、ECAR、迁移、侵袭和增殖
体内异种移植瘤实验
评估RRAD敲低对肿瘤生长的影响及GLUT inhibitor-1的治疗效果
将sh-RRAD稳定敲低的HN4细胞注射到裸鼠皮下，分为四组：sh-Scr、sh-RRAD、sh-Scr+GLUT inhibitor-1、sh-RRAD+GLUT inhibitor-1，测量肿瘤体积和重量
临床样本验证
确认RRAD与GLUT3在人OSCC组织中的表达关系及其临床意义
IHC和多重免疫荧光检测原发灶中RRAD、GLUT3和Ki-67表达，TMA验证相关性，TCGA构建风险模型
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间代谢组学 | AFADESI质谱成像平台 | Beijing Victor Technology Co., Ltd. | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 空间转录组学 | GeoMx数字空间分析仪 | NanoString | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | RRAD抗体 | Abcam | ab177151 |
| GLUT3抗体 | Proteintech | 20403-1-AP | |
| IHC | RRAD抗体 | Abcam | ab238584 |
| GLUT3抗体 | Proteintech | 20403-1-AP | |
| Ki-67抗体 | Proteintech | 28074-1-AP | |
| 多重免疫荧光 | 多重免疫组化检测试剂盒 | Zen-Bioscience | 18003 |
| Ca2+检测 | Fluo-4 AM钙离子荧光探针 | Beyotime | -- |
| 动物实验 | GLUT抑制剂-1 | MedChem Express | HY-139605 |
| 葡萄糖摄取实验 | 2-NBDG荧光葡萄糖类似物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| ADP:ATP比率检测 | ADP:ATP比率检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| 代谢通量分析 | XF96细胞外通量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| 核质分离 | 核质蛋白提取试剂盒 | Beyotime | -- |
| EdU实验 | EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷） | Beyotime | -- |
| ChIP实验 | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | P2078 |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室（未包被和Matrigel包被） | Corning | -- |
| mRNA测序 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| VAHTS Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme | -- | |
| RT-PCR | SYBR Premix Ex Taq II试剂 | TaKaRa | -- |
| M-MLV逆转录酶 | TaKaRa | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | SPF Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（CAL27、HN4、HN30），培养基为DMEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素，37°C、5% CO2 阅读提示：详见‘Cell culture’部分 |
| siRNA转染 | siRNA序列（RRAD #1: 5′-GCGAGAGAGCCUUGGCAAATT-3′），脂质体转染试剂Lipofectamine 3000，转染后24小时进行后续实验 阅读提示：详见‘Cell transfection’部分 |
| 代谢检测 | 葡萄糖摄取（2-NBDG 5×10^3细胞）、乳酸（1×10^4细胞24小时）、ADP:ATP比率、ECAR（30,000细胞/孔） 阅读提示：详见‘Glucose uptake assay’、‘Lactate product assay’、‘Measurement of the ADP:ATP ratio’、‘Metabolic flux assay’ |
| Western blot | 总蛋白25μg，10% SDS-PAGE，一抗稀释度（RRAD ab177151、GLUT3 20403-1-AP等），内参GAPDH和Histone H3 阅读提示：详见‘Western blot analysis’部分 |
| 体内实验 | 6周龄雌性BALB/c nude mice，每组5只，皮下注射1×10^6细胞，GLUT inhibitor-1口服30mg/kg，前两周每日一次，肿瘤体积每周测量 阅读提示：详见‘Animal studies’部分 |