检测肿瘤微环境中的黑色素体
验证黑色素瘤发展各阶段组织中是否含有黑色素体阳性巨噬细胞。
对复合痣、原位黑色素瘤、垂直生长黑色素瘤和淋巴结转移标本进行H&E和免疫荧光染色，检测CD68、GPNMB和HMB45。
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回收的黑色素瘤分泌的黑色素体调节肿瘤相关巨噬细胞的多样化
Recycled melanoma-secreted melanosomes regulate tumor-associated macrophage diversification.
实验完整度
高包含体外细胞共培养、体内小鼠移植瘤模型、临床患者样本分析，以及转录组、蛋白质组和功能验证等多层级证据。
主要模型
MNT1黑色素瘤细胞系 HaCaT角质形成细胞系 人原代真皮成纤维细胞 人原代单核细胞来源巨噬细胞 B16-F10小鼠黑色素瘤细胞系 小鼠骨髓来源巨噬细胞 C57BL/6小鼠移植瘤模型 黑色素瘤患者组织样本
重点核对
黑色素体来源细胞（MNT1、角质形成细胞、成纤维细胞） 巨噬细胞与黑色素体共培养时间（24小时） B16-F10细胞与巨噬细胞共移植比例（1:5） C57BL/6小鼠周龄（7-8周）和性别（雌性） AKT抑制剂Capivasertib和mTOR抑制剂Rapamycin的使用浓度（100 nM）
摘要
细胞外囊泡（EV）是细胞间通讯的重要介质。在这里，我们揭示了一种由黑色素体介导的新的细胞间通讯模式，黑色素体是黑色素细胞分泌的用于黑色素转运的大型EV。与小EV不同，小EV在受体细胞内被分解，而黑色素体在受体细胞内保持完整，获得独特的蛋白质特征，并可以进一步作为“二手”EV转移到另一个细胞。我们表明，通过表皮角质形成细胞或真皮成纤维细胞传代的黑色素瘤分泌的黑色素体可以进一步被常驻巨噬细胞吞噬。这一过程导致巨噬细胞极化为促肿瘤或促免疫细胞浸润表型。通过成纤维细胞转移的黑色素体可以携带AKT1，AKT1以mTOR依赖性方式诱导巨噬细胞分泌VEGF，在体内促进血管生成和转移。在黑色素瘤患者中，与AKT1共定位的巨噬细胞与疾病侵袭性相关，免疫治疗无应答者富含含有黑色素体标志物的巨噬细胞。我们的研究结果表明，由二手细胞外囊泡介导的相互作用有助于转移微环境的形成，阻断黑色素体对巨噬细胞多样化的线索可能有助于阻止黑色素瘤的进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 黑色素瘤分泌的黑色素体能否通过角质形成细胞和成纤维细胞间接传递给巨噬细胞，并影响其表型多样化及肿瘤进展？
- 核心机制
- 成纤维细胞来源的黑色素体携带AKT1，通过mTOR依赖性途径诱导巨噬细胞分泌VEGF，从而促进血管生成和转移。
- 主要证据
- 体外共培养和体内移植实验显示，成纤维细胞来源的黑色素体处理的巨噬细胞增强肿瘤生长和血管生成；AKT1和mTOR抑制剂可逆转这些效应。
- 研究意义
- 研究提出阻断黑色素体诱导的巨噬细胞多样化可能有助于阻止黑色素瘤进展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证黑色素体的细胞间转移
确定黑色素瘤来源的黑色素体能否被角质形成细胞和成纤维细胞摄取并保持完整。
将MNT1来源的黑色素体与HaCaT细胞、原代成纤维细胞共培养，通过TEM和免疫荧光分析细胞内黑色素体。
验证巨噬细胞对第二手黑色素体的摄取
测试角质形成细胞和成纤维细胞能否将内化的黑色素体进一步传递给巨噬细胞。
用PKH67标记的黑色素体培养角质形成细胞和成纤维细胞，分离内化的黑色素体，再与巨噬细胞共培养，通过TEM和ImageStream分析。
评估巨噬细胞不同来源黑色素体对肿瘤特征的影响
确定不同来源黑色素体（黑色素瘤、角质形成细胞、成纤维细胞）处理的巨噬细胞对肿瘤生长、血管生成和转移的影响。
将BMDMs与不同来源的黑色素体孵育后，与B16-F10细胞共同皮下注射到C57BL/6小鼠中，测量肿瘤体积、生物发光、血管化、转移和免疫细胞浸润。
转录组和蛋白质组分析
分析不同来源黑色素体对巨噬细胞转录组的影响以及黑色素体蛋白质组成的差异。
对与不同来源黑色素体共培养的巨噬细胞进行RNA-seq和GSEA分析，通过质谱分析黑色素体蛋白质组。
验证AKT1/mTOR通路在血管生成中的作用
确定成纤维细胞来源黑色素体中的AKT1是否通过mTOR途径诱导巨噬细胞促进血管生成。
用胰蛋白酶处理去除膜蛋白，Western blot检测AKT1；用AKT抑制剂和mTOR抑制剂处理巨噬细胞，检测VEGF分泌和HDBEC管形成。
临床样本验证
评估黑色素体相关巨噬细胞标志物是否与免疫治疗反应和疾病进展相关。
分析免疫治疗应答者和无应答者的组织芯片，检测黑色素体标志物；用流式细胞术分析淋巴结活检中的巨噬细胞亚群。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biological Industries | -- |
| RPMI培养基 | Biological Industries | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 细胞分选 | 生物素标记抗人CD14抗体 | BioLegend | 325624 |
| MojoSort链霉亲和素纳米磁珠 | BioLegend | 480016 | |
| 细胞因子处理 | 巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | 216-MC-025 |
| 干扰素-γ | -- | -- | |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 白细胞介素-13 | -- | -- | |
| 白细胞介素-4 | -- | -- | |
| 黑色素体标记 | PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒 | Sigma-Aldrich | PKH67GL-1KT |
| 溶酶体染色 | LysoTracker溶酶体探针 | Thermo Fisher Scientific | L12492 |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Vector Laboratories | -- |
| 抗CD68抗体 | Cell Signaling Technology | 76437S | |
| 抗GPNMB抗体 | R&D Systems | AF2550 | |
| 抗HMB45抗体 | abcam | ab732 | |
| 抗FSP1抗体 | abcam | ab27957 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| Western blot | 抗DCT抗体 | Abcepta | AP8771A |
| 抗TYR抗体 | Santa Cruz | sc-20035 | |
| 抗GPR143抗体 | Bioss | Bs-11791R | |
| 抗CD9抗体 | System Biosciences | EXOAB-CD9A-1 | |
| 抗CD63抗体 | Santa Cruz | sc-5275 | |
| 抗Syntenin抗体 | Santa Cruz | sc-515538 | |
| 流式细胞术 | 抗CD8a APC-Vio770抗体 | Miltenyi Biotec | 130-120-737 |
| 抗CD4 FITC抗体 | BioLegend | 100406 | |
| 抗CD11b PE抗体 | Miltenyi Biotec | 130-113-806 | |
| 抗CD45 APC抗体 | Miltenyi Biotec | 130-110-660 | |
| 抗TRAF6 Alexa Fluor 488抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8409 | |
| 抗TLR3 PE抗体 | BioLegend | 141903 | |
| 抗SNCA Alexa Fluor 594抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-12767 | |
| CD68 APC/Cyanine 7抗体 | BioLegend | 333821 | |
| 细胞培养 | 中性蛋白酶II | Roche | -- |
| 胶原酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 氯仿 | Bio-Lab | 3082301 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| 组织学染色 | 伊红Y溶液 | Sigma-Aldrich | HT110232 |
| DPX封片剂 | Sigma-Aldrich | 06522 | |
| 动物麻醉 | 异氟烷 | Piramal Critical Care, Inc. | -- |
| 细胞增殖检测 | WST-1试剂 | Sigma-Aldrich | 5015944001 |
| 黑色素定量 | 合成黑色素 | MP Biomedical | 8049-97-6 |
| 血管生成实验 | 基底膜提取物 | R&D Systems | 3445-005-01 |
| VEGF检测 | 人VEGF ELISA试剂盒 | Boster Bio | EK0539 |
| 蛋白质印迹 | 胰蛋白酶 | Biological Industries | -- |
| 肿瘤细胞注入 | 荧光素 | Promega | -- |
| 小动物成像 | IVIS小动物活体成像系统 | Caliper Life Sciences, PerkinElmer | -- |
| 超声成像 | Vevo 3100高频成像系统 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | -- |
| MX550D探头 | FUJIFILM VisualSonics Inc. | -- | |
| 透射电镜 | Tecnai透射电子显微镜 | Phillips | -- |
| 蔡司EM 912透射电子显微镜 | ZEISS | -- | |
| 纳米颗粒追踪分析 | NanoSight LM10纳米颗粒分析仪 | Malvern Instruments | -- |
| 流式细胞术 | Cytoflex4L流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| Cytoflex5L流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 黑色素体分离 | 黑色素体来源细胞（MNT1等）、分泌时间（5天）、离心条件（300×g、1000×g、20,000×g） 阅读提示：Methods: Melanosome isolation |
| 巨噬细胞分化 | 单核细胞分离方法、M-CSF浓度（50 ng/mL）、分化时间（7天） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 黑色素体与巨噬细胞共培养 | 黑色素体浓度、共培养时间（24小时） 阅读提示：Methods: Conditioned media preparation |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系、性别、周龄（C57BL/6J雌性7-8周）、细胞比例（1:5）、细胞数量（B16-F10 1×10^5）、注射方式（皮下） 阅读提示：Methods: Mouse melanoma model |
| AKT1/mTOR通路验证 | 抑制剂浓度（Capivasertib 100 nM，rapamycin 100 nM）、处理时间（6小时或24小时） 阅读提示：Methods: Conditioned media preparation, Figure 5 |