表达模式分析
分析miR-542-3p在不同物种和肌生成过程中的表达模式。
通过整合分析肌肉营养不良患者、猪和山羊骨骼肌发育的差异miRNA，鉴定miR-542-3p为唯一重叠miRNA；进行序列保守性分析；在C2C12细胞诱导分化后检测miR-542-3p表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MicroRNA-542-3p靶向Pten抑制成肌细胞增殖，但抑制肌原性分化不依赖于靶向Pten
MicroRNA-542-3p targets Pten to inhibit the myoblasts proliferation but suppresses myogenic differentiation independent of targeted Pten.
实验完整度
高包含细胞模型（C2C12、293T）、功能获得与缺失实验（增殖和分化）、双荧光素酶报告基因验证靶基因及拯救实验。
主要模型
C2C12成肌细胞 HEK293T（293T）细胞
重点核对
miR-542-3p mimic转染浓度为80 nM，inhibitor为100 nM si-Pten转染浓度为100 nM 增殖检测在转染后48小时进行 分化检测在诱导后3天进行 分化培养基含2%马血清
摘要
背景：非编码RNA是骨骼肌发育和产后生长的关键表观遗传调控因子，据报道miR-542-3p在不同物种的骨骼肌中保守且高表达。然而，它在肌肉干细胞增殖和肌生成中的确切功能仍有待确定。方法：使用miR-542-3p模拟物和抑制剂转染增殖和分化状态的C2C12细胞。采用RT-qPCR、EdU染色、免疫荧光染色、细胞计数试剂盒8（CCK-8）和Western blot评估miR-542-3p引起的增殖和肌原性分化。采用双荧光素酶报告基因分析和靶基因的拯救实验揭示分子机制。结果：数据显示，过表达miR-542-3p下调增殖标记基因的mRNA和蛋白水平，减少EdU+细胞和细胞活力。此外，敲低它促进了上述表型。对于分化，miR-542-3p功能获得降低了肌原性基因（包括MYOG、MYOD1等）的mRNA和蛋白水平。此外，用MYHC抗体免疫染色的免疫荧光显示，与对照组相比，miR-542-3p模拟物组的肌管数量、荧光强度、分化指数和肌管融合指数均降低。相反，在miR-542-3p抑制剂组中这些表型呈增加趋势。机制上，通过双荧光素酶报告基因检测，磷酸酶和张力蛋白同源物（Pten）被鉴定为miR-542-3p的真正的靶基因，si-Pten与miR-542-3p抑制剂联合处理完全拯救了miR-542-3p功能缺失对增殖的促进作用。结论：本研究表明miR-542-3p抑制成肌细胞的增殖和分化，Pten是miR-542-3p在成肌细胞增殖中的依赖性靶基因，但在分化中不是。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-542-3p在成肌细胞增殖和肌原性分化中的具体作用及其分子机制。
- 核心机制
- miR-542-3p直接靶向Pten的3'UTR，抑制Pten表达，从而抑制成肌细胞增殖；但抑制分化不依赖于Pten。
- 主要证据
- RT-qPCR、Western blot、EdU染色和CCK-8实验表明miR-542-3p抑制增殖，双荧光素酶报告基因验证Pten为直接靶基因，si-Pten与miR-542-3p抑制剂共转染拯救增殖表型，但未拯救分化表型。
- 研究意义
- 有助于理解miR-542-3p调控成肌细胞增殖和分化的具体作用模式，并扩展在miRNA水平研究骨骼肌的知识。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
过表达miR-542-3p对增殖的影响
验证miR-542-3p过表达对成肌细胞增殖的影响。
用miR-542-3p mimic转染C2C12细胞，检测增殖标志基因和蛋白表达、EdU掺入和细胞活力。
敲低miR-542-3p对增殖的影响
验证miR-542-3p敲低对成肌细胞增殖的影响。
用miR-542-3p inhibitor处理C2C12细胞，检测增殖标志基因和蛋白表达、EdU掺入和细胞活力。
miR-542-3p对分化的影响
验证miR-542-3p对成肌细胞分化的影响。
转染mimic或inhibitor后诱导分化，检测肌原性标志基因和蛋白表达、肌管形态和融合。
靶基因预测和验证
预测并验证miR-542-3p的直接靶基因。
利用生物信息学软件预测靶基因，构建Pten野生型和突变型双荧光素酶报告载体，进行双荧光素酶报告基因实验，并检测Pten的表达。
Pten功能验证和拯救实验
验证Pten在miR-542-3p调控增殖和分化中的作用。
敲低Pten观察对增殖和分化的影响，并共转染si-Pten和miR-542-3p inhibitor进行拯救实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | AlphaCell | 100,061 | |
| 青霉素-链霉素 | Biosharp | BL505A | |
| 马血清 | Solarbio | S9050 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Vazyme | R401-01 |
| RNA浓度测定 | Nanodrop ND-1000分光光度计 | Thermo Fisher | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT预混液 | Takara | -- |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| SYBR实时PCR混合液 | BioTeke | -- | |
| Bio-Rad CFX96系统 | Bio-Rad | -- | |
| EdU染色 | 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Beyotime | C0078S |
| DAPI | -- | -- | |
| CCK-8检测 | CCK-8试剂盒 | AbMole | M4839 |
| 酶标仪 | Perkin Elmer | -- | |
| 免疫荧光染色 | 山羊血清 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| TritonX-100 | -- | -- | |
| MYHC抗体 | DSHB | MF | |
| Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG | Invitrogen | A11011 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L/FITC | Bioss | bs-0296G-FITC | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM800 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Biosharp | BL521B | |
| SDS-PAGE凝胶 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗Pten抗体 | Bioss | bsm-33319M | |
| β-actin抗体 | Bioss | bsm-33036M | |
| CCND1抗体 | Wanleibio | WL01435a | |
| CCNB1抗体 | Wanleibio | WL01760 | |
| MYOG抗体 | Abcam | ab124800 | |
| MYOD1抗体 | Wanleibio | WL04662 | |
| 双荧光素酶报告基因检测 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | DL101-01 |
| 靶基因预测 | TargetScan 7.2 | -- | -- |
| miRDB | -- | -- | |
| DIANA | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | C2C12细胞生长培养基成分（DMEM、10%FBS、1%PS），分化培养基（2%马血清），培养条件（37°C、5%CO2） 阅读提示：Methods - Cell culture |
| 细胞转染 | miR-542-3p mimic (80 nM)，inhibitor (100 nM)，si-Pten (100 nM) 的浓度，转染试剂（Lipofectamine 3000） 阅读提示：Methods - Cell transfection |
| 增殖检测 | 转染后48小时检测，EdU浓度和孵育时间（10 µM，2小时），CCK-8检测时间点（12、24、48、72小时） 阅读提示：Methods - EdU staining, CCK-8 assay |
| 分化检测 | 转染后24小时诱导分化，诱导后3天检测，分化培养基成分（2%马血清） 阅读提示：Methods - Cell transfection, Figure legends 4 and 5 |
| 双荧光素酶报告基因 | 293T细胞共转染，48小时后检测，野生型/突变型Pten 3'UTR载体 阅读提示：Methods - Dual-Luciferase reporter assay, Figure 6 |