GelMA合成与表征
制备用于细胞包封的GelMA水凝胶，并验证其甲基丙烯酰化程度。
通过明胶与甲基丙烯酸酐反应合成GelMA，使用TNBS测定取代度，并通过1H NMR验证结构。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
生长因子偶联的GelMA水凝胶中包封的HUVECs和ADSCs共培养增强血管样网络形成
Enhanced Vascular-like Network Formation of Encapsulated HUVECs and ADSCs Coculture in Growth Factors Conjugated GelMA Hydrogels.
实验完整度
中包含材料合成与表征、体外细胞实验（活/死染色、CCK-8、免疫荧光）等功能验证，但缺乏动物模型或患者样本等体内证据层级。
主要模型
GelMA水凝胶包封的HUVECs和hADSCs共培养体系 HUVECs（人脐静脉内皮细胞） hADSCs（人脂肪来源干细胞）
重点核对
共培养培养基比例：M199:ADSC 50:50 细胞接种密度：hADSCs 7.5×10^4 cells/mL，HUVECs 7.5×10^4 cells/mL LAP光引发剂浓度：0.08%（w/v） GelMA浓度：15%（w/v） 蓝光照射时间：30秒（1 mm厚水凝胶）
摘要
组织工程主要旨在缓解全球器官捐献不足的问题。然而，由于天然器官结构的复杂性，尤其是器官内部允许食物-废物转移的血管系统，工程化组织的存活常常受到损害。因此，工程化组织内的血管化至关重要。这一努力的一个关键方面是能够复制细胞外基质的复杂性，并促进工程构建物内功能性血管网络的形成。在本研究中，人类脂肪来源干细胞（hADSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在不同类型的甲基丙烯酸明胶（GelMA）中共培养。简言之，通过EDC/NHS偶联反应将促血管生成信号生长因子（GFs），即血管内皮生长因子（VEGF165）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），偶联到GelMA上。偶联有VEGF165（GelMA@VEGF165）和bFGF（GelMA@bFGF）的GelMA水凝胶显示出GelMA水凝胶的化学和物理特性略有变化。此外，这些生长因子的偶联改善了水凝胶构建物内的细胞活力和细胞增殖。此外，主要在GelMA@生长因子（GelMA@GF）水凝胶上观察到血管样网络形成，特别是在GelMA@bFGF上。这项研究表明，生长因子偶联的GelMA水凝胶将成为3D血管组织工程的有前景的生物材料。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究将促血管生成的生长因子VEGF165和bFGF偶联到GelMA水凝胶上，是否能增强包封的HUVECs和hADSCs共培养体系中的血管样网络形成。
- 核心机制
- bFGF具有广泛的促有丝分裂和血管生成活性，影响干细胞、平滑肌细胞等多种细胞类型，而VEGF主要作用于内皮细胞，因此bFGF偶联的GelMA更有效地促进细胞生长和血管结构形成。
- 主要证据
- 在体外3D共培养中，GelMA@bFGF和GelMA@VEGF165水凝胶包封细胞后，LIVE/DEAD染色显示细胞活力增强，CCK-8增殖实验显示细胞增殖增加，免疫荧光显示CD31阳性血管样网络结构形成，其中GelMA@bFGF效果最显著。
- 研究意义
- 作者提出生长因子偶联是增强组织工程血管化的有前景策略，可能促进药物发现、癌症研究、干细胞发育和再生医学等领域。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生长因子偶联与定量
将VEGF165和bFGF偶联到GelMA上，并定量偶联量。
通过EDC/NHS化学偶联方法将生长因子偶联至GelMA，并使用ELISA试剂盒定量。
水凝胶物理表征
评估不同浓度和生长因子偶联对GelMA水凝胶微观结构、机械性能、溶胀和降解的影响。
通过SEM观察孔隙形态，流变仪测量储能模量，重量法测定溶胀率和酶降解。
细胞培养与共培养条件优化
确定HUVECs和hADSCs共培养的最佳培养基比例。
在2D培养中测试5种不同比例的M199和ADSC培养基，通过CCK-8评估细胞增殖。
细胞包封与体外生物相容性
评估包封在GelMA和GelMA@GF水凝胶中细胞的活力和增殖。
将HUVECs和hADSCs包封在水凝胶中，使用LIVE/DEAD染色和CCK-8检测。
血管样网络形成评估
观察包封细胞在GelMA和GelMA@GF水凝胶中血管样结构的形成。
通过免疫荧光染色标记CD31、CD90和α-SMA，显示细胞重组和网络形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| GelMA合成 | 猪皮明胶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 甲基丙烯酸酐 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 生长因子偶联 | EDC | Sigma-Aldrich | -- |
| NHS | Sigma-Aldrich | -- | |
| 血管内皮生长因子165 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| ELISA定量 | 人VEGF165 ELISA试剂盒 | MyBioSource | -- |
| bFGF ELISA试剂盒 | Bioss Antibodies | -- | |
| 细胞培养 | M199培养基 | Gibco | -- |
| 内皮细胞生长添加剂 | Merck | -- | |
| 胎牛血清 | Peak | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ADSC生长培养基套装 | Lonza | -- | |
| 细胞活性检测 | 活/死细胞活力/细胞毒性试剂盒 | Thermo Fisher Sciences | -- |
| 免疫荧光染色 | 小鼠抗人CD31抗体 | Invitrogen | -- |
| 兔抗人α-SMA抗体 | Proteintech | -- | |
| 驴抗人CD90抗体 | Biotechne/R&D Systems | -- | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠二抗 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 555标记驴抗兔二抗 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 633标记驴抗绵羊二抗 | -- | -- | |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| 形态学分析 | 溅射镀膜仪 | Quorum Technologies | -- |
| 扫描电子显微镜 | Hitachi | SU-3500 | |
| 机械性能测量 | 流变仪 | Anton-Paar | MCR302 |
| 细胞成像 | 共聚焦显微镜 | Leica | TCS SP5 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GelMA合成 | 明胶来源、浓度、甲基丙烯酸酐量、反应时间、pH、透析截留分子量 阅读提示：Materials and Methods 2.1 GelMA Synthesis |
| 生长因子偶联 | GelMA与EDC/NHS比例、生长因子浓度、反应时间、温度、透析条件 阅读提示：Materials and Methods 2.3 Conjugation of VEGF and FGF on GelMA |
| 水凝胶制备 | LAP浓度（0.08% w/v）、GelMA浓度（15% w/v）、蓝光照射时间（30秒） 阅读提示：Materials and Methods 2.5 Physical Characterization |
| 细胞共培养 | HUVECs和hADSCs的比例、培养基比例（M199:ADSC 50:50）、细胞密度（7.5×10^4 cells/mL） 阅读提示：Materials and Methods 2.6 Cell Culture 和 2.7 In Vitro Biocompatibility |
| 血管网络形成评估 | 培养时间（7天）、培养基、抗体浓度、成像参数 阅读提示：Materials and Methods 2.7.2 Cell Morphology and 3D Organization |