超声处理迷迭香乙醇提取物及其壳聚糖纳米颗粒对感染柔嫩艾美耳球虫肉鸡的预防和治疗效果

Prophylactic and Therapeutic Efficacy of Ultrasonicated Rosmarinus officinalis Ethanolic Extract and its Chitosan-Loaded Nanoparticles Against Eimeria tenella Infected Broiler Chickens.

作者信息Shaimaa M Kasem, Nabila M Mira, Ibrahim B Helal, Magdy E Mahfouz
PMID38492183
发布时间2024-03
DOI10.1007/s11686-024-00793-3

实验完整度

研究包含体外纳米颗粒表征、分子鉴定、动物感染模型、组织病理学、免疫组化、基因表达等多个独立实验层级,并进行了功能验证和机制验证。

主要模型

Ross肉鸡 Eimeria tenella感染模型

重点核对

感染剂量:初次感染4×10⁴个孢子化卵囊,二次感染8×10⁴个孢子化卵囊 治疗组给药方式:感染后5天连续口服5天,剂量为UROEE 100 mg/kg体重、CsNPs 20 mg/kg体重、UROEE-CsNPs 20 mg/kg体重 预防组给药方式:从第1天至第42天日粮中添加UROEE 100 mg/kg、CsNPs 20 mg/kg、UROEE-CsNPs 20 mg/kg 组织取样时间:预防组在27日龄(6 DPPI)和41日龄(6 DPSI),治疗组在31日龄(6 DPT)和41日龄(6 DPSI) 统计方法:使用SPSS进行单因素方差分析和Tukey HSD检验,P<0.05为显著性

摘要

目的:研究超声处理迷迭香乙醇提取物(UROEE)及其壳聚糖纳米颗粒(UROEE-CsNPs)作为日粮预防剂和治疗方法对感染柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)肉鸡的体内功效。方法:鸡在21日龄感染4×10⁴个E. tenella卵囊进行初次感染,在35日龄感染8×10⁴个卵囊进行二次感染。设立11个实验组。预防组从第1天至第42天在日粮中添加100 mg/kg UROEE和20 mg/kg CsNPs及UROEE-CsNPs。治疗组使用相同剂量连续治疗5天。计数粪便中的卵囊排出量。进行组织病理学和免疫组织化学研究。使用半定量逆转录PCR分析促炎细胞因子(IFN-γ、IL-1β、IL-6)和抗炎细胞因子(IL-10、TGF-β4)的基因表达。结果:结果显示UROEE、CsNPs和UROEE-CsNPs能够减少卵囊排出并改善盲肠组织结构。CD4+和CD8+ T淋巴细胞蛋白表达降低。E. tenella感染导致初次感染后促炎细胞因子(IFN-γ、IL-1β、IL-6)和抗炎细胞因子(TGF-β4)的表达上调,而二次感染后其表达下调。结论:日粮预防性添加剂和治疗性处理UROEE、CsNPs和UROEE-CsNPs可降低对E. tenella的炎症反应,表现为卵囊排出减少、组织病理学改善、CD4+和CD8+ T细胞蛋白表达降低以及初次和二次感染后所测细胞因子mRNA表达水平降低。因此,这些结果将有助于制定更好的防治策略,作为日粮预防剂或治疗手段来控制家禽球虫病。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
研究旨在评估超声处理迷迭香乙醇提取物及其壳聚糖纳米颗粒对感染柔嫩艾美耳球虫肉鸡的体内预防和治疗效果。
核心机制
UROEE、CsNPs及其纳米颗粒通过降低促炎细胞因子(IFN-γ、IL-1β、IL-6)和抗炎细胞因子(TGF-β4)的mRNA表达,减少CD4+和CD8+ T淋巴细胞蛋白表达,从而减轻炎症反应,改善盲肠组织病理学。
主要证据
预防和治疗处理显著减少粪便卵囊排出(P<0.05),组织病理学显示盲肠结构改善,免疫组化显示CD4+和CD8+ T细胞表达降低,半定量RT-PCR显示细胞因子mRNA表达下调。
研究意义
作者提出这些结果将有助于制定更好的防治策略,用于家禽球虫病的控制和预防,作为日粮预防剂或治疗手段,可能成为商业抗球虫药物的替代品。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

纳米颗粒制备与表征

制备并表征UROEE、CsNPs及UROEE-CsNPs,确认其形态和尺寸。

用离子凝胶法制备CsNPs,将超声处理的迷迭香乙醇提取物负载到CsNPs上形成UROEE-CsNPs,并通过SEM和TEM观察形态和尺寸。

2

E. tenella卵囊的收集、孢子化与分子鉴定

获得并确认E. tenella卵囊的纯度和感染性。

从自然感染鸡的盲肠收集卵囊,在2.5%重铬酸钾溶液中孢子化,并用PCR扩增ITS-1区域进行分子鉴定。

3

动物分组与感染处理

建立预防和治疗模型,评估不同处理的体内效果。

将165只一日龄Ross肉鸡随机分为11组,包括阴性对照、阳性对照、添加剂组、预防组和治疗组。在21日龄进行初次感染,35日龄进行二次感染。

4

粪便卵囊排出量检测

评估各处理对E. tenella繁殖的抑制作用。

从感染后4天起,每隔两天收集新鲜粪便,使用McMaster计数室法计算每克粪便中的卵囊数(OPG)。

5

组织病理学检查

评估盲肠组织的病理变化和药物干预的组织修复效果。

在特定时间点收集盲肠组织,固定、包埋、切片(5 µm),H&E染色,光镜观察。

6

免疫组织化学检测CD4+和CD8+ T细胞

检测盲肠组织中T淋巴细胞亚群的蛋白表达水平。

使用抗鸡CD4和CD8多克隆抗体进行免疫组化染色,半定量分析阳性细胞表达。

7

细胞因子基因表达分析

评估促炎和抗炎细胞因子mRNA表达的变化。

提取盲肠组织RNA,逆转录成cDNA,通过半定量RT-PCR分析IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10和TGF-β4的mRNA表达,以GAPDH为内参。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
壳聚糖Oxford, Mumbai, India--
三聚磷酸钠Sigma-Aldrich--
冰乙酸ADWIC, Egypt--
无水乙醇ADWIC, Egypt--
扫描电子显微镜JEOLJSM-IT-100
透射电子显微镜JEOLJEM 2100
QIAamp DNA粪便迷你试剂盒Qiagen--
Nanodrop One微量紫外可见分光光度计Thermo Scientific™--
PCR预混液Bioline--
热循环仪SENSOQUESTLab cycler
DNA上样缓冲液enzynomicsB002S
50 bp DNA标记iNtRON Biotechnology24072
溴化乙锭----
紫外透射仪VWR InternationalPhoto-Doc-It™
光学显微镜LEICADM650
显微相机LEICAICC50 HD
抗鸡CD4蛋白多克隆抗体BiOSS ANTIBODIESbs-0647R-TR
抗鸡CD8α蛋白多克隆抗体BiOSS ANTIBODIESbs-4791R
UltraVision One HRP聚合物----
DAB显色剂----
旋转切片机Reichert-Jung820 H
RNA保护液BioFluxBSC54M1
Simply P总RNA提取试剂盒BioFluxBSC52M2
EasyScript®第一链cDNA合成SuperMix试剂盒TransGen BiotechAE301
2X TOPsimple™ DyeMix-nTaqenzynomics170523
Techne TC-3000X PCR热循环仪TechneTC-3000X
ImageJ软件--Java 1.83.0

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物分组与感染
分组数量、每组鸡数、感染剂量、感染时间点
阅读提示:Methods: Experimental Design, Diets and Infection
预防组处理
添加剂剂量、给药方式(日粮添加)、给药持续时间
阅读提示:Methods: Feeding of Experimental Broiler Chickens, 表3注
治疗组处理
治疗触发时间、治疗持续时间、给药方式、剂量
阅读提示:Methods: Experimental Design, Diets and Infection
卵囊计数
粪便收集时间点、计数方法
阅读提示:Methods: Measurements, Oocysts Output
组织病理学和免疫组化
取样时间点、组织部位、固定方式、切片厚度、抗体信息和染色方法
阅读提示:Methods: Histopathological Studies, Immunohistochemical Studies
基因表达分析
组织取样时间点、RNA提取方法、引物序列、PCR条件、内参基因
阅读提示:Methods: Gene Expression of Some Immune Genes..., Table 2