生物信息学分析核心生物钟基因在月经周期及RIF中的表达
识别在月经周期各阶段和RIF中差异表达的核心生物钟基因，并筛选潜在靶基因。
从GEO数据库获取GSE4888和GSE111974数据集，分析9个核心生物钟基因在不同月经周期阶段和RIF患者与对照中的表达差异，并使用WGCNA识别与PER2共表达的基因。
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计算机模拟、体外和体内分析鉴定复发性植入失败中的子宫内膜生物钟基因
In Silico, In Vitro, and In Vivo Analysis Identifies Endometrial Circadian Clock Genes in Recurrent Implantation Failure
实验完整度
高包含生物信息学分析（GEO数据集、WGCNA）、临床样本验证（RIF与对照组子宫内膜）、细胞功能实验（PER2 siRNA敲低）等多个独立证据层级，并有功能验证。
主要模型
人子宫内膜组织（WOI期） 原代人子宫内膜基质细胞（hESCs） GEO数据集（GSE4888、GSE111974）
重点核对
PER2及其靶基因（SHTN1、KLF5、STEAP4等）在RIF患者与对照组子宫内膜中的表达差异 PER2 siRNA敲低后hESCs中靶基因的表达变化 用于分析月经周期和RIF的GEO数据集（GSE4888和GSE111974） 子宫内膜活检组织的获取时间（WOI，排卵后第7天）和样本量（每组30例）
摘要
背景：先前的研究已经证明了生物钟在卵巢类固醇激素合成中的作用，并将与生物钟基因节律失常相关的胚胎植入失败归因于卵巢来源的孕酮合成不足。关于子宫内膜本身核心生物钟基因的表达及其在子宫内膜容受性受损和复发性植入失败（RIF）中可能作用的研究有限。目的：我们旨在评估人类子宫内膜在整个月经周期中的核心生物钟基因表达图谱，以及植入窗口（WOI）子宫内膜容受性和RIF中可能的基因相互作用网络。方法：该研究最初是一项计算机模拟研究，并通过来自原代人子宫内膜基质细胞（hESCs）以及从临床研究中心接受妇科手术的60名女性获得的子宫内膜活检组织进行了实验室验证。研究包括30名RIF女性和30名年龄和体重指数匹配的对照组。结果：对跨越月经周期和RIF女性与对照组的人类子宫内膜微阵列数据集进行初步数据挖掘和生物信息学分析，证明了核心生物钟基因在月经周期中的差异表达，包括PER2在WOI和RIF中的关键作用。研究了以PER2为中心的网络在子宫内膜容受性调控中的作用。我们还证实了RIF女性子宫内膜中SHTN1、RXFP1、KLF5和STEAP4的mRNA表达明显增加，与PER2的趋势相同，而MT1E和FKBP5没有变化。在hESCs中处理PER2 siRNA验证了PER2对SHTN1、KLF5和STEAP4的正调控。结论：子宫内膜PER2的异常表达可能通过调控SHTN1、KLF5和STEAP4导致子宫内膜容受性受损和RIF的发生。关键词：生物钟，period 2，子宫内膜容受性，复发性植入失败
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 子宫内膜中核心生物钟基因的表达是否与子宫内膜容受性和复发性植入失败（RIF）相关？
- 核心机制
- PER2通过正向调控SHTN1、KLF5和STEAP4的表达，可能损害子宫内膜容受性，进而促进RIF的发生。
- 主要证据
- 生物信息学分析（GEO数据集、WGCNA）显示PER2在WOI期表达升高，在RIF患者中表达增加，并通过qPCR和免疫组化在RIF患者子宫内膜中验证；在hESCs中敲低PER2后SHTN1、KLF5和STEAP4表达下降。
- 研究意义
- 本研究首次通过计算机模拟和实验结合的方法，揭示了子宫内膜生物钟基因PER2在RIF发病中的潜在作用，为RIF的诊断和治疗提供了新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床样本验证PER2及其靶基因在RIF患者子宫内膜中的表达
验证生物信息学预测的PER2及其靶基因在RIF患者子宫内膜中的异常表达。
收集30例RIF患者和30例对照的子宫内膜活检组织（WOI期），通过RT-qPCR检测PER2、SHTN1、RXFP1、KLF5、STEAP4、MT1E、FKBP5的mRNA水平，并通过免疫组化检测PER2蛋白水平。
细胞实验验证PER2对靶基因的调控
验证PER2对潜在靶基因的调控作用。
在hESCs中转染PER2 siRNA，通过RT-qPCR检测PER2、KLF5、SHTN1、STEAP4、MT1E、RXFP1、FKBP5的mRNA表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 达尔伯克改良伊格尔培养基/Ham's F12 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 抗生素抗真菌溶液 | Gibco | -- | |
| 蛋白质检测 | 抗PER2抗体 | Abcam | ab179813 |
| 细胞角蛋白18抗体 | Proteintech | 10830-1-AP | |
| 波形蛋白抗体 | Proteintech | 60330-1-Ig | |
| RNA提取和逆转录 | 动物总RNA提取试剂盒 | FOREGENE | -- |
| 逆转录试剂盒 | TAKARA | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 细胞分离 | I型胶原酶 | -- | -- |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 40微米细胞筛网 | BD Biosciences | -- |
| 免疫荧光 | 4孔腔室玻片 | Millipore | -- |
| 显微镜 | 荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| 免疫组织化学 | 显微镜 | Zeiss | -- |
| 统计分析 | SPSS软件 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 生物信息学分析 | GEO数据集（GSE4888和GSE111974）的样本分组、样本量、差异表达基因阈值（|log2FC|>1且调整后P<0.05） 阅读提示：Methods部分：Datasets、Differentially Expressed Genes、WGCNA |
| 临床样本收集 | 子宫内膜活检获取时间（WOI，排卵后第7天）、样本量（每组30例）、样本来源（Ren Ji Hospital） 阅读提示：Methods部分：Clinical Sample Collection和Table 2 |
| RT-qPCR | 引物序列、内参基因（β-ACTIN）、ΔΔCt方法 阅读提示：Methods部分：Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction |
| 细胞培养与siRNA转染 | hESCs来源（PE期）、PER2 siRNA序列、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、转染后培养时间（48小时） 阅读提示：Methods部分：Cell Culture、Transfection of Small Interfering RNA With Liposome |
| 免疫组织化学 | PER2抗体浓度（1:100）、组织切片厚度（5μm） 阅读提示：Methods部分：Immunohistochemistry |