筛选抗炎化合物
鉴定能够抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症反应的化合物。
使用LPS刺激RAW264.7细胞，检测不同化合物处理后培养上清中NO的水平，筛选出最有效的抗炎化合物LY2874455。
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药理学诱导自噬通过降解免疫蛋白酶体亚基减轻巨噬细胞炎症
Pharmacological induction of autophagy reduces inflammation in macrophages by degrading immunoproteasome subunits.
实验完整度
高包含细胞筛选、蛋白组学、基因敲除/敲低、免疫共沉淀、动物模型等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
RAW264.7巨噬细胞 小鼠腹腔巨噬细胞(PM) 小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM) LPS诱导急性肺损伤小鼠模型
重点核对
细胞系：RAW264.7、腹腔巨噬细胞、骨髓来源巨噬细胞 药物处理：LY2874455（2μM）、LPS（20ng/ml）、ONX-0914（1μM） 基因敲除/敲低：ATG7敲除、p62敲低 自噬抑制剂：氯喹（CQ）、渥曼青霉素、巴弗洛霉素A1 动物模型：LPS诱导急性肺损伤、DSS诱导结肠炎
摘要
自噬功能障碍与促炎性疾病有关。然而，自噬限制炎症的机制仍不清楚。在这里，我们发现在脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中，泛FGFR抑制剂LY2874455能有效激活自噬并抑制促炎因子的表达。多重蛋白质组学分析确定免疫蛋白酶体（20S组成型蛋白酶体的特定亚型）是选择性自噬降解的底物。SQSTM1/p62被发现是介导这种降解的选择性自噬相关受体。自噬缺陷或p62敲低阻断LY2874455的作用，导致免疫蛋白酶体积累和炎症反应增强。免疫蛋白酶体抑制剂可以逆转自噬缺陷巨噬细胞中促炎因子的表达，证实了免疫蛋白酶体周转在自噬介导的促炎因子表达抑制中的关键作用。在小鼠中，LY2874455可保护LPS诱导的急性肺损伤和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎，并导致促炎细胞因子和免疫蛋白酶体水平降低。这些发现表明，免疫蛋白酶体的选择性自噬是先天免疫系统信号传导的关键调节因子。自噬通过选择性降解胞质货物维持细胞稳态，该通路的缺陷可导致多种促炎性疾病。这项研究表明，免疫蛋白酶体的选择性降解调节先天炎症信号。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 自噬如何通过降解免疫蛋白酶体来限制炎症反应？
- 核心机制
- LY2874455抑制FGFR活性，下调AKT-mTOR信号通路，激活自噬；自噬受体p62通过其UBA结构域识别泛素化的免疫蛋白酶体亚基，介导其选择性自噬降解，从而降低免疫蛋白酶体水平，抑制NF-κB信号通路，减少促炎因子的表达。
- 主要证据
- 在LPS刺激的RAW264.7细胞中，LY2874455显著降低免疫蛋白酶体亚基（LMP2、LMP7、LMP10）的蛋白水平和酶活性；ATG7敲除或p62敲低可阻断LY2874455的降解作用；免疫共沉淀证明p62与LMP2/LMP7相互作用且依赖于p62的UBA结构域；在ATG7敲除细胞中，免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914可逆转炎症因子的高表达。
- 研究意义
- 该研究揭示了一种自噬通过选择性降解免疫蛋白酶体来抑制炎症的新机制，为炎症性疾病（如脓毒症和克罗恩病）的治疗提供了潜在的新靶点和策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证LY2874455的体外抗炎作用
验证LY2874455在LPS刺激的巨噬细胞中的抗炎作用。
在RAW264.7、腹腔巨噬细胞、BMDM和THP-1细胞中，检测LY2874455对NO、ROS及促炎因子表达的影响。
验证LY2874455的体内抗炎作用
验证LY2874455在体内对炎症性疾病的保护作用。
利用LPS诱导的急性肺损伤和脓毒症模型及DSS诱导的结肠炎模型，评估LY2874455对组织损伤、炎症因子和生存率的影响。
蛋白质组学分析鉴定LY2874455的靶点
寻找LY2874455处理后表达水平发生变化的蛋白，以揭示其作用机制。
对LPS和LY2874455处理的RAW264.7细胞进行质谱蛋白质组学分析，发现免疫蛋白酶体亚基下调。
验证LY2874455对免疫蛋白酶体的影响
验证LY2874455是否特异性降低免疫蛋白酶体而非组成型蛋白酶体的水平。
通过Western blot检测免疫蛋白酶体亚基和组成型蛋白酶体亚基的蛋白水平，并测量免疫蛋白酶体亚基的酶活性。
验证LY2874455激活自噬
验证LY2874455是否激活自噬，并确定其依赖的降解途径。
使用自噬抑制剂和自噬报告系统（mCherry-EGFP-LC3）检测自噬通量，通过透射电镜观察自噬体形成，并检测自噬底物p62的水平。
验证LY2874455通过自噬受体p62促进免疫蛋白酶体降解
验证免疫蛋白酶体的降解是否通过自噬途径和受体p62介导。
使用ATG7敲除和p62敲低的RAW264.7细胞，检测免疫蛋白酶体亚基的蛋白水平及其与LC3的共定位，并通过免疫共沉淀验证p62与免疫蛋白酶体亚基的相互作用。
验证LY2874455的抗炎作用依赖于自噬途径
验证LY2874455的抗炎作用是否依赖于自噬途径及免疫蛋白酶体的降解。
在自噬抑制剂处理或ATG7敲除、p62敲低的细胞中检测促炎因子的表达，并检验免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914能否逆转自噬缺陷导致的炎症。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因组编辑和基因敲低
蛋白质组学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | LY2874455 | MCE | -- |
| 脂多糖（大肠杆菌，血清型055:B5） | Sigma | -- | |
| ONX-0914 | -- | -- | |
| 氯喹 | -- | -- | |
| 渥曼青霉素 | -- | -- | |
| 巴弗洛霉素A1 | -- | -- | |
| MG132 | -- | -- | |
| AZD4547 | MCE | -- | |
| 聚肌胞苷酸 | MCE | -- | |
| 蛋白检测 | 抗SQSTM-1/p62抗体 | Abcam | ab109012 |
| 抗LMP2抗体 | Abcam | ab3328 | |
| 抗LMP7抗体 | Abcam | ab3329 | |
| 抗泛素抗体 | Abcam | ab7780 | |
| 抗NBR1抗体 | Abcam | ab55474 | |
| 抗ATG7抗体 | Abcam | ab133528 | |
| 抗mTOR抗体 | Abcam | ab87540 | |
| 抗LMP10抗体 | Abcam | ab183506 | |
| 抗PSMB5抗体 | Abcam | ab90867 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗PSMB1抗体 | Proteintech | 11749-1-AP | |
| 抗PSMB2抗体 | Proteintech | 15154-1-AP | |
| 抗LC3抗体 | Cell Signaling Technology | 2775S | |
| 抗磷酸化AktSer473抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| 抗磷酸化mTORSer2448抗体 | Cell Signaling Technology | 2971S | |
| 抗p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9202S | |
| 抗磷酸化p70S6KThr421/Ser424抗体 | Cell Signaling Technology | 9204S | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4685S | |
| 抗TNF-α抗体 | Cell Signaling Technology | 11948S | |
| 抗磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | Bioss | bs-0982R | |
| 抗IL-6抗体 | Bioss | bs-0782R | |
| 抗磷酸化IκB-α (Ser32)抗体 | ABclonal Technology | AP0707 | |
| 抗TRIF抗体 | ABclonal Technology | A1155 | |
| 抗MYD88抗体 | ABclonal Technology | A0980 | |
| 抗TRAF6抗体 | ABclonal Technology | A16991 | |
| 抗TAK1抗体 | ABclonal Technology | A19077 | |
| 抗TAB2抗体 | ABclonal Technology | A9867 | |
| 抗IL-1β抗体 | Abcam | ab216995 | |
| 抗IL-18抗体 | Abcam | ab207323 | |
| HRP偶联抗兔二抗 | BBI Life Sciences | D-110058 | |
| HRP偶联抗小鼠二抗 | BBI Life Sciences | D-110087 | |
| 荧光检测 | DCFH-DA（2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯） | Beyotime | S0033S |
| NO检测 | 一氧化氮检测试剂盒 | Beyotime | S0021S |
| 蛋白提取 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma (Roche) | 11697498001 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Sigma | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Sigma | -- | |
| 转染 | jetprime转染试剂 | Polyplus | -- |
| RNA提取 | Fast Pure细胞/组织总RNA提取试剂盒 | Nanjing Vazyme Biotek | -- |
| 逆转录 | Superscript II逆转录酶试剂盒 | Nanjing Vazyme | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green试剂 | Nanjing Vazyme | -- |
| 蛋白酶体活性检测 | Ac-ANW-AMC荧光底物 | -- | -- |
| Ac-PAL-AMC荧光底物 | -- | -- | |
| Ac-Arg-Leu-Arg-AMC荧光底物 | -- | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Sigma | -- |
| Western blot成像 | Chemidoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 免疫沉淀 | GFP亲和珠 | Shenzhen Sports Life Technology Company | -- |
| 荧光显微镜 | Zeiss LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| Zeiss Apotome荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| 流式细胞术 | BD流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 吸光度检测 | 多功能酶标仪 | Biotek | -- |
| 质谱分析 | nanoElute超高效液相色谱系统 | Bruker Daltonics | -- |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- | |
| 透射电镜 | Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜 | FEI Company | -- |
| 结肠炎诱导 | 葡聚糖硫酸钠（分子量36,000-50,000） | MP Biomedicals | -- |
| 细胞处理 | 过氧化氢 | -- | -- |
| 大肠杆菌 | -- | -- | |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞实验 | 细胞系、LPS和LY2874455的浓度及处理时间、检测指标（NO、ROS、细胞因子、蛋白表达） 阅读提示：Materials and methods: Macrophage culture and isolation; ROS detection; Nitric oxide (NO) concentration measurements; qRT-PCR |
| 自噬检测 | 自噬抑制剂（CQ、wortmannin、Bafilomycin A1）的使用浓度、mCherry-EGFP-LC3转染、LC3和p62的蛋白水平 阅读提示：Materials and methods: Antibodies and reagents; Results: LY2874455 activated autophagy; Figure legends 4D-4I |
| 基因敲除/敲低 | ATG7敲除、p62敲低的细胞系、gRNA和shRNA序列，以及CRISPR-Cas9和慢病毒感染的具体条件 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction and DNA transfection; Results: LY2874455 promoted the degradation of immunoproteasomes through autophagy and the selective receptor p62 |
| 蛋白质组学 | 质谱数据及分析软件参数 阅读提示：Materials and methods: Mass spectrometry-based proteomics analysis |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、周龄、给药剂量、给药方式、模型诱导方法、组织采集时间 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments; Induction of ALI; Induction of sepsis; Induction of colitis |