化学探针与光催化剂筛选
鉴定高效的标记弹头和光催化剂，以实现线粒体特异性和标记效率。
设计并合成了基于QM和thioQM的可激活探针，在体外用BSA比较标记效率，选择SF2探针；在活细胞中评估铱光催化剂（Ir1~Ir6）的线粒体靶向性和催化活性，优化选择Ir1。
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原代活体样本中的生物正交光催化邻近标记
Bioorthogonal photocatalytic proximity labeling in primary living samples.
实验完整度
高包含体外蛋白标记、多种细胞系验证、小鼠组织及人原代T细胞蛋白质组分析、糖尿病模型比较蛋白质组学及功能验证等多层次证据。
主要模型
HeLa细胞 HEK293T细胞 K562细胞 小鼠肾脏和脾脏原代细胞 人外周血原代T细胞
重点核对
光催化剂Ir1浓度：贴壁细胞100 nM，悬浮细胞20-50 nM 标记探针SF2浓度：100 μM 蓝光照射条件：450 nm，~4 mW/cm²，12分钟 蛋白质组学分析的+/−催化剂比率截断值（HeLa、HEK293T、K562为5.0，肾脏为2.0，脾脏为8.0，T细胞为7.0） 生物学重复数：蛋白质组学实验为3个生物学重复
摘要
在原代活体系统（如天然组织或临床样本）中对亚细胞蛋白质组进行原位分析对于理解生命过程和疾病至关重要，但由于方法学障碍而具有挑战性。在此，我们报告了CAT-S，一种生物正交光催化化学驱动的邻近标记方法，它将邻近标记扩展到广泛的原代活体样本，用于线粒体蛋白质组的原位分析。通过我们的thioQM标记弹头开发和靶向生物正交光催化化学，CAT-S能够在活细胞中高效且特异性地标记线粒体蛋白。我们将CAT-S应用于多种细胞培养物、解离的小鼠组织以及人血液中的原代T细胞，描绘了天然状态的线粒体蛋白质组特征，并揭示了隐藏的线粒体蛋白（PTPN1、SLC35A4 uORF和TRABD）。此外，CAT-S能够量化功能障碍组织中的蛋白质组扰动，以糖尿病小鼠肾脏为例，揭示了可能驱动疾病进展的脂质代谢改变。鉴于非遗传操作、通用性和时空分辨率的优势，CAT-S可能为原本无法触及的原代样本的亚细胞蛋白质组研究开辟令人兴奋的途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在不进行基因操作的情况下，在原代活体样本中原位捕获亚细胞蛋白质组？
- 核心机制
- CAT-S利用靶向线粒体的铱光催化剂，在蓝光照射下通过生物正交光催化脱笼反应生成高反应活性的thioQM标记弹头，实现对线粒体蛋白的邻近标记。
- 主要证据
- 在HeLa、HEK293T、K562细胞中，CAT-S标记的线粒体蛋白特异性达79-87%，且覆盖线粒体基质蛋白组的36-37%；在小鼠肾、脾和人T细胞中特异性为61-64%；并鉴定出PTPN1、SLC35A4 uORF和TRABD为新的线粒体蛋白。
- 研究意义
- CAT-S作为一种无需基因操作的方法，能够对原代活体样本进行原位亚细胞蛋白质组分析，为研究生理和病理过程提供了新的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞系线粒体蛋白质组分析
验证CAT-S在多种细胞系中捕获线粒体蛋白质组的能力和特异性。
对HeLa、HEK293T和K562细胞进行CAT-S标记，通过质谱分析鉴定富集蛋白，并评估与已知线粒体蛋白的重叠和特异性。
验证新发现的线粒体蛋白
验证CAT-S鉴定出的未经注释但定位在线粒体的蛋白。
通过t-SNE分析从CAT-S数据中筛选出候选孤儿蛋白，在HEK293T细胞中过表达V5标签蛋白，通过免疫荧光共定位确认其线粒体定位。
小鼠组织线粒体蛋白质组分析
将CAT-S应用于小鼠肾脏和脾脏组织分离的原代细胞，分析其线粒体蛋白质组特征。
从C57BL/6J小鼠取出肾脏和脾脏，解离成细胞悬液，去除红细胞，进行CAT-S标记和质谱分析。
糖尿病小鼠肾脏比较蛋白质组学
比较肥胖糖尿病小鼠与正常小鼠肾脏线粒体蛋白质组的差异，揭示疾病相关的蛋白变化。
使用db/db小鼠和m/m小鼠，CAT-S标记后，采用三标二甲基标记进行相对定量，分析差异表达蛋白，并用免疫印迹验证。
人原代T细胞线粒体蛋白质组分析
将CAT-S应用于人外周血原代T细胞，分析其线粒体蛋白质组。
从健康供体外周血中分离PBMC，通过磁珠负选获得T细胞，进行CAT-S标记和质谱分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 体外蛋白标记 | 牛血清白蛋白 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞增殖 | CellTiter 96 Aqueous One Solution试剂盒 | Promega | G3581 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1线粒体膜电位探针 | Bioss | D-9113 |
| 蛋白质印迹 | 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Solarbio | SE068 |
| 小鼠抗生物素单克隆抗体 | Santa Cruz | sc-101339 | |
| 兔抗HSP60单克隆抗体 | Abcam | ab45134 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| 免疫荧光 | 兔抗AIF单克隆抗体 | Abcam | ab32516 |
| 山羊抗兔AlexaFluor546 | Invitrogen | A-11010 | |
| 链霉亲和素-AlexaFluor488 | Invitrogen | S11223 | |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| 小鼠抗V5单克隆抗体 | Biodragon | B1005 | |
| 山羊抗兔AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11008 | |
| 山羊抗小鼠AlexaFluor555 | Invitrogen | A-21422 | |
| 蛋白质组学样品制备 | 高容量链霉亲和素树脂珠 | Thermo | 20357 |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| C18吸头 | Thermo | 87784 | |
| Luna 3-μm C18(2)填料 | Phenomenex | -- | |
| RIPA强裂解液 | CWBIO | CW2333S | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Bimake | B14001 | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 三乙基碳酸氢铵缓冲液 | -- | -- | |
| 甲醛 | -- | -- | |
| SYPRO Ruby蛋白凝胶染色试剂盒 | Invitrogen | S12001 | |
| 细胞转染 | Opti-MEM培养基 | -- | -- |
| 聚乙烯亚胺 | -- | 9002-98-6 | |
| 分子克隆 | Hifair第一链cDNA合成预混液 | YEASON | 11141ES |
| TRIzol试剂 | -- | -- | |
| Phanta Max超保真DNA聚合酶 | Vazyme | P505-d1 | |
| Exnase MultiS | Vazyme | C113-02 | |
| DpnI限制性内切酶 | Thermo | ER1701 | |
| 细胞分离 | EasySep人T细胞分离试剂盒 | STEMCELL technologies | 17951 |
| 红细胞裂解液 | TIANGEN | RT122 | |
| PBMC分离试剂盒 | Solarbio | P8610 | |
| 蛋白标记 | Ir1 | J&K Scientific | -- |
| SF2 | 文中未明确说明 | -- | |
| 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | -- | -- | |
| MitoTracker深红染料 | Thermo | -- | |
| Cu-BTTAA | -- | -- | |
| 抗坏血酸钠 | -- | -- | |
| DADPS | Confluore Biological Technology | BBBD-19 | |
| 5×SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Matrigel基质胶 | Corning | 356234 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 光催化剂与探针孵育 | Ir1浓度：贴壁细胞100 nM，悬浮细胞20-50 nM；SF2浓度100 μM；孵育时间：Ir1 30分钟，SF2 30分钟 阅读提示：Methods: In cellulo CAT-S for miscellaneous assays |
| 蓝光照射 | 蓝光波长450 nm，强度~4 mW/cm²，照射时间12分钟 阅读提示：Methods: In cellulo CAT-S for miscellaneous assays |
| 质谱数据过滤 | +/−催化剂比率截断值：HeLa、HEK293T、K562为5.0；肾脏为2.0；脾脏为8.0；T细胞为7.0 阅读提示：Methods: CAT-S mitochondrial proteomics for general cells, CAT-S mitochondrial proteomics for living tissues, Mitochondrial proteomic profiling for human primary T cells |
| 糖尿病比较蛋白质组学 | db/db小鼠（10-11周龄）和m/m小鼠（10-11周龄）；每组3只；三标二甲基标记条件 阅读提示：Methods: Comparative mitochondrial proteomics for diabetic and healthy mice |
| 人T细胞样品 | 每样本约3×10^7 T细胞；Ir1浓度20 nM；SF2 100 μM；蓝光照射12分钟 阅读提示：Methods: Mitochondrial proteomic profiling for human primary T cells |