全基因组CRISPR-Cas9筛选
鉴定在布鲁氏菌感染中影响细胞活力的宿主基因
利用GeCKOv2文库构建HeLa基因敲除文库，以MOI 0.3感染慢病毒，经嘌呤霉素筛选后进行布鲁氏菌感染，并在10次传代中富集，通过sgRNA丰度分析鉴定候选基因。
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全基因组CRISPR筛选鉴定宿主基因对布鲁氏菌胞内存活至关重要
A genome-wide CRISPR screen identified host genes essential for intracellular Brucella survival.
实验完整度
中包含CRISPR全基因组筛选、细胞活力检测、胞内菌计数、Western blot验证自噬等实验，但缺少动物模型和患者样本验证，机制验证较为单一。
主要模型
HeLa细胞 HEK293T细胞 布鲁氏菌16M株
重点核对
MOI=100的感染条件 基因敲除细胞系的构建（lentiCRISPRv2） CCK8法检测细胞活力 CFU计数检测胞内菌 LC3II蛋白水平检测自噬
摘要
布鲁氏菌是一种人畜共患的兼性胞内菌，对人类健康和经济安全构成威胁。胞内感染是布鲁氏菌的一个标志性特征，也是其致病的主要原因，通过该过程，细菌调节宿主细胞内环境以促进自身的定植和复制，逃避宿主免疫和药物杀伤。目前对布鲁氏菌胞内过程的研究通常以细菌表型（如胞内细菌存活）为前提，随后采用生化或分子生物学方法揭示详细机制。虽然这些过程可以加深对布鲁氏菌-宿主相互作用的理解，但对感染中宿主变化的洞察可能局限于已知通路。在本研究中，我们应用CRISPR Cas9筛选在基因组水平上鉴定受布鲁氏菌感染影响最大的宿主基因。通过CRISPR筛选，我们首先发现敲除负筛选基因GOLGA6L6、DEFB103B、OR4F29和ERCC6会降低宿主细胞和胞内布鲁氏菌的活力，表明这些基因可能是控制布鲁氏菌的潜在治疗靶点。特别是，敲除DEFB103B通过改变宿主细胞自噬降低了布鲁氏菌的胞内存活。相反，敲除正筛选基因则促进布鲁氏菌的胞内增殖。总之，我们在布鲁氏菌感染的整个过程中在基因组水平上筛选了宿主基因，确定了先前未被认识到的参与布鲁氏菌感染的宿主基因，并为胞内感染控制提供了靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些宿主基因影响布鲁氏菌感染过程中的细胞活力，并可能作为控制布鲁氏菌胞内感染的靶点？
- 核心机制
- DEFB103B敲除通过降低宿主细胞自噬水平，进而减少布鲁氏菌的胞内存活。
- 主要证据
- CRISPR筛选鉴定出负筛选基因GOLGA6L6、DEFB103B、OR4F29和ERCC6；这些基因敲除后，细胞活力下降且胞内菌减少；DEFB103B敲除细胞中LC3II表达降低。
- 研究意义
- 本研究首次在基因组水平上筛选出与布鲁氏菌感染相关的宿主基因，为胞内感染控制提供了潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选基因敲除细胞系的构建与验证
验证筛选结果，确认基因敲除对细胞表型的影响
针对GOLGA6L6、DEFB103B、TBC1D3F、Rpl17-C18orf32等基因设计sgRNA，构建lentiCRISPRv2载体并包装慢病毒感染HeLa细胞，通过基因组DNA测序验证敲除。
细胞活力与胞内菌检测
评估基因敲除对宿主细胞活力及胞内布鲁氏菌存活的影响
对敲除细胞系进行布鲁氏菌感染，在2.5天、4.5天、7天分别检测细胞活力（CCK8）和胞内菌数量（CFU计数）。
自噬水平检测
探究DEFB103B敲除对宿主细胞自噬的影响
通过Western blot检测LC3B蛋白水平，比较野生型HeLa细胞和DEFB103B敲除细胞在布鲁氏菌感染前后的自噬水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选宿主基因
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证胞内菌存活
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | EallBio | 03.1006C |
| 胎牛血清 | Every Green | 11011-8611 | |
| Brucella感染 | 庆大霉素 | -- | -- |
| CRISPR筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 免疫荧光 | FITC偶联二抗 | Invitrogen | F-2765 |
| 鬼笔环肽 | Invitrogen | A12381 | |
| DAPI | Bestvio | BB-4401 | |
| 基因敲除 | lentiCRISPRv2质粒 | -- | -- |
| pSPAS2质粒 | -- | -- | |
| pMD2G质粒 | -- | -- | |
| 基因敲除验证 | 鼠直接PCR试剂盒 | Bimake | B40013 |
| 5分钟通用连接预混液 | Vazyme | C311-01 | |
| Trelief 5α感受态细胞 | Tsingke | TSC-C01 | |
| 细胞活力检测 | CCK8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 酶标仪 | Thermo Scientific | Multiskan | |
| Western blot | 5×SDS-PAGE上样缓冲液 | Solarbio | P1043 |
| BCA蛋白定量试剂 | Thermo Scientific | A55864 | |
| 硝酸纤维素膜 | Cytiva | 10600003 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与试剂 | 细胞系HeLa和HEK293T的培养基成分（DMEM、10%FBS、100 U/mL青霉素/链霉素） 阅读提示：Materials and Methods, 'Bacteria and cell lines' |
| Brucella感染 | MOI=100，感染2小时后更换含庆大霉素(10 mg/mL)培养基以去除胞外菌 阅读提示：Materials and Methods, 'Brucella infection' |
| CRISPR筛选 | GeCKOv2文库的准确性、慢病毒感染MOI=0.3、嘌呤霉素浓度2 µg/mL、初始文库细胞数2.4×10^7、感染后传代10次 阅读提示：Materials and Methods, 'Genome-wide CRISPR screen for Brucella infection' |
| 基因敲除 | sgRNA序列是否正确、质粒构建和病毒包装细节 阅读提示：Materials and Methods, 'Generation of knockout cell lines' 及Table 1 |
| 细胞活力检测 | CCK8检测前细胞接种密度、感染后处理时间、检测时的细胞数 阅读提示：Materials and Methods, 'Cell viability assay' |
| 胞内菌计数 | 细胞裂解方法、TSA平板培养条件、CFU计数时间 阅读提示：Materials and Methods, 'Intracellular bacterial culture' |
| 自噬检测 | Western blot中使用的LC3B抗体及其稀释比例、蛋白上样量（20 µg） 阅读提示：Materials and Methods, 'Western blotting' 及Results 'DEFB103B affected...' |