多组学数据获取与预处理
获取肝癌患者的基因表达、DNA甲基化、拷贝数变异和体细胞突变数据，并进行标准化处理。
从TCGA数据库下载肝癌原发肿瘤样本的数据，使用TCGABiolinks包获取表达、甲基化、CNVs和突变数据，经过标准化和log2转换，以及甲基化分组和突变矩阵转换。
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基于整合素细胞表面相互作用通路相关基因的多组学筛选构建肝癌预后预测模型
Construction of a prognostic prediction model in liver cancer based on genes involved in integrin cell surface interactions pathway by multi-omics screening.
实验完整度
高包含多组学生存分析、预后模型构建与外部验证、免疫浸润分析、RT-qPCR验证及细胞功能实验（CCK-8、凋亡、迁移、Western blot），提供多层级证据。
主要模型
HepG2细胞系（ITGAV过表达） Hep3B2-1-7细胞系（ITGAV敲低） 肝癌患者血液样本（RT-qPCR验证） TCGA肝癌队列（多组学分析与模型构建）
重点核对
TCGA数据库中肝癌原发肿瘤样本，仅保留基因表达量>100的基因，并经过log2转换 风险评分模型公式：Risk Score = (COL4A2 * 0.065143343) + (COMP * -0.189426999) + (ITGAV * 0.074265423) + (SPP1 * 0.124743891)，以中位数为截断值分为高低风险组 RT-qPCR验证使用了20例复发肝癌患者的血液样本，区分3个月和6个月复发 细胞功能实验选用HepG2和Hep3B2-1-7细胞系，分别进行ITGAV过表达和敲低实验
摘要
背景：肝癌是一种常见的恶性肿瘤，近年来发病率不断上升。我们旨在通过整合临床信息和基因的多组学特征，构建一个模型来预测肝癌患者的生存期。方法：整合多组学数据以识别与肝癌生存相关的信号通路。然后，基于特定通路中的关键基因建立预后风险评分模型，接着分析风险评分与临床特征的关系，并对预测模型中包含的关键基因进行分子和免疫学特征分析。进行功能实验以进一步阐明其潜在的分子机制。结果：共鉴定出4条与肝癌患者生存相关的通路。在整合素细胞表面相互作用通路中，COMP和SPP1的低表达以及COL4A2和ITGAV的低拷贝数变异水平与预后显著相关。基于上述4个基因，建立了预后风险评分模型。风险评分、ITGAV和SPP1与活化树突状细胞的相关性最为显著。COL4A2和COMP分别与1型T辅助细胞和调节性T细胞的相关性最为显著。列线图（包含T分期和风险评分）可能更好地预测短期生存。细胞实验表明，ITGAV的过表达促进肿瘤发生。结论：由四个基因（COMP、SPP1、COL4A2和ITGAV）构建的风险评分模型可用于预测肝癌患者的生存期。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用多组学数据识别与肝癌患者生存相关的信号通路，并基于关键基因构建预后预测模型以及探究其分子机制？
- 核心机制
- ITGAV可能通过激活BCL2、PXN和MAPK的表达来促进肝癌的发生发展。
- 主要证据
- 细胞实验显示ITGAV过表达促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，抑制凋亡，并上调BCL2、PXN和MAPK蛋白水平；风险评分模型在TCGA和GSE141198数据集中得到验证。
- 研究意义
- 该风险评分模型可能用于预测肝癌患者的生存期，为肝癌的诊断和治疗决策提供帮助，ITGAV可能作为潜在的诊断生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基于MOSClip的生存相关通路与模块分析
识别与肝癌患者生存显著相关的信号通路和模块。
使用MOSClip工具对多组学数据进行降维，通过Cox比例风险回归模型分析通路和模块与生存的关联，通过重采样策略筛选显著通路。
预后风险评分模型构建与验证
基于整合素细胞表面相互作用通路中的关键基因构建风险评分模型，并验证其预测能力。
从UCSC Xena下载关键基因的RNA-seq数据，使用LASSO和多因素Cox回归构建风险评分模型，根据中位风险评分将患者分为高低风险组，并在GSE141198数据集中验证。
风险评分与临床特征关联分析
评估风险评分作为独立预后因素的能力，并构建预测生存的列线图。
通过单因素和多因素Cox分析确定T分期和风险评分为独立预后因素，构建包含T分期和风险评分的列线图，并通过校准曲线和决策曲线分析评估其预测价值。
关键基因表达分析与ceRNA网络构建
分析关键基因的表达水平并构建其调控网络。
在TCGA和GSE144269数据集中分析关键基因的mRNA表达，在UALCAN中分析蛋白表达，通过GSE36915筛选差异miRNA，结合ENCORI数据库预测miRNA和lncRNA，构建ceRNA网络。
预后、诊断价值及药物预测分析
评估关键基因的预后和诊断价值，并预测潜在靶向药物。
根据关键基因表达中位数分组，进行Kaplan-Meier生存分析，绘制ROC曲线计算AUC，并通过DGIdb数据库预测靶向药物。
免疫微环境浸润分析
比较高低风险组间免疫细胞浸润差异及关键基因与免疫细胞的相关性。
使用ssGSEA算法评估免疫细胞浸润，计算免疫评分、基质评分和肿瘤纯度，分析关键基因与免疫细胞的相关性，并评估免疫检查点表达。
RT-qPCR验证关键基因表达
在肝癌患者血液样本中验证关键基因的表达模式。
提取复发后3个月和6个月患者的血液RNA，通过RT-qPCR检测COMP、ITGAV和SPP1的表达。
ITGAV细胞功能实验
探究ITGAV对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。
在HepG2细胞中过表达ITGAV，在Hep3B2-1-7细胞中敲低ITGAV，进行CCK-8、细胞周期、凋亡、划痕和Transwell实验，并通过Western blot检测相关蛋白表达。
Western blot分析机制相关蛋白
验证ITGAV对BCL2、PXN和MAPK蛋白表达的影响。
提取转染后细胞蛋白，通过Western blot检测BCL2、PXN和MAPK的表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNAliquid超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒 | Beijing Huitian Oriental Technology Co. LTD | -- |
| cDNA合成 | FastQuant反转录酶 | TIANGEN | -- |
| RT-qPCR | ABI 7300实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞培养 | MEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | APExBIO | -- |
| 细胞周期检测 | 细胞周期试剂 | 4A BIOTECH | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 细胞凋亡检测 | 细胞凋亡试剂 | 4A BIOTECH | -- |
| 膜联蛋白V/FITC | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液试剂盒 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | MDL | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗肌动蛋白抗体 | CST | T0022 | |
| 抗Bcl-2抗体 | BIOSS | bs-0032R | |
| 抗ITGAV抗体 | BIOSS | bs-2203R | |
| 抗MAPK抗体 | BIOSS | bs-0637R | |
| 抗PXN抗体 | Immuno Way | YT-3606 | |
| HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L） | Proteintech | -- | |
| ECL Western blot检测试剂 | -- | -- | |
| ChemiDoc MP化学发光成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多组学数据预处理 | 数据获取标准、基因过滤阈值、标准化方法 阅读提示：Materials and methods: Data retrieval and cleaning |
| 预后模型构建 | LASSO回归的参数设置、风险评分计算公式、高风险组划分阈值 阅读提示：Materials and methods: Construction of prognostic risk scoring model; Results: Construction of prognostic risk scoring model |
| RT-qPCR验证 | 样本量（20例）、复发时间分组（3个月和6个月）、RNA提取和cDNA合成步骤、PCR条件 阅读提示：Materials and methods: Real time qPCR validation |
| 细胞功能实验 | 细胞系（HepG2和Hep3B2-1-7）、培养条件（MEM培养基、10% FBS等）、转染试剂和步骤、检测时间点 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection; Results: Overexpression of ITGAV promotes tumor cell proliferation... |
| 蛋白表达检测 | 抗体稀释比例（1:1000-1:2000）、封闭和孵育条件、曝光时间 阅读提示：Materials and methods: Western blotting analysis |