TOC模型的建立与TOC-ID50测定
确定MG感染气管器官培养的半数感染剂量，以标准化后续感染实验。
制备18日龄SPF鸡胚的气管环，以不同稀释度的MG-HY菌液感染，观察纤毛停止运动的时间，根据Reed-Muench法计算TOC-ID50。
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鸡败血支原体感染后雏鸡气管的炎症反应与屏障破坏：聚焦TNF-α-NF-κB/MLCK通路
Inflammatory responses and barrier disruption in the trachea of chicks following Mycoplasma gallisepticum infection: a focus on the TNF-α-NF-κB/MLCK pathway.
实验完整度
中包括气管器官培养模型建立、组织病理学、qRT-PCR、Western blot和免疫组化等实验，但缺乏动物体内实验和功能验证。
主要模型
鸡胚气管器官培养（TOC）模型
重点核对
MG-HY菌株的TOC-ID50为10^-4.47/200 μL 感染时间点：3、5、7 dpi 每组样本量n=8（每个时间点） MG 16S基因引物序列和qRT-PCR条件
摘要
鸡败血支原体（MG）可诱导家禽气管黏膜的持续性炎症损伤，并引起鸡的慢性呼吸道疾病。为进一步研究MG诱导气管黏膜损伤的机制，我们采用鸡胚气管器官培养（TOC）作为模型，研究MG的入侵和繁殖、MG对气管形态的影响以及促进MG组织入侵的潜在因素。结果表明，MG感染显著损伤气管上皮结构，削弱气管上皮屏障功能；MG还增加了细菌移位发生的概率，感染后5天和7天，感染TOC的细菌载量显著增加（p < 0.05）。此外，MG显著（p < 0.05）增加了炎性细胞因子如TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6的表达水平，并激活NF-κB信号通路，导致NF-κB p65核转位增加。同时，丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPK）被激活。这种激活可能与肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化增加有关，这可能导致肌动蛋白-肌球蛋白收缩和紧密连接（TJ）蛋白功能破坏，可能损害上皮屏障完整性，并进一步促进MG向组织内迁移。总之，我们的结果有助于更好地理解MG与宿主之间的相互作用，深入了解MG感染诱导气管黏膜损伤的机制，并为鸡败血支原体体内感染的可能途径提供新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鸡败血支原体感染如何损伤鸡气管黏膜屏障，其机制是否涉及TNF-α-NF-κB/MLCK通路？
- 核心机制
- MG感染通过上调TNF-α等炎性细胞因子，激活NF-κB信号通路，进而上调MLCK表达，促进MLC磷酸化，导致肌动蛋白收缩和紧密连接蛋白表达下降，破坏气管上皮屏障。
- 主要证据
- 在鸡胚气管器官培养模型中，MG感染导致气管上皮形态损伤，细菌载量增加，炎性细胞因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）表达上调，NF-κB p65核转位增加，MLC磷酸化增加，紧密连接蛋白claudin-1、ZO-1和occludin表达下降。
- 研究意义
- 研究为MG感染导致气管黏膜损伤的机制提供新见解，并为开发预防和治疗策略提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MG感染模型建立与病理学评估
观察MG感染后气管黏膜的形态学变化，确认感染模型成功。
以TOC-ID50浓度的MG-HY菌液感染气管环，在3、5、7 dpi收集样品，进行大体观察和H&E染色，评估组织病理学评分。
MG载量与分布检测
定量和定位MG在气管组织中的载量和分布。
提取TOC中的细菌DNA，通过qRT-PCR定量MG 16S基因拷贝数；FISH实验使用Cy3标记探针定位MG。
炎性细胞因子mRNA表达分析
评估MG感染对炎性细胞因子基因表达的影响。
提取TOC总RNA，通过qRT-PCR检测TNF-α、IL4、IL6、IL-8、IFN-γ、IL-1β、CXCL14和iNOS2的mRNA表达量。
NF-κB/MLCK通路蛋白表达分析
验证MG感染是否激活TNF-α-NF-κB/MLCK信号通路。
Western blot检测TNF-α、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、MLCK、MLC2和P-MLC2的蛋白表达水平。
紧密连接蛋白表达分析
评估MG感染对紧密连接蛋白表达和分布的影响。
通过qRT-PCR检测claudin-1、ZO-1和occludin的mRNA表达；通过免疫组化检测蛋白表达及定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因表达分析
统计分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 气管器官培养 | 199 Hanks培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 青霉素/链霉素 | Biochrom | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Biochrom | -- | |
| 感染模型建立 | 牛血清白蛋白 | Carl Roth | -- |
| 菌株培养 | 改良Hayflick培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 酵母提取物 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | -- | -- | |
| DNA提取 | DNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- |
| qPCR | 7900HT快速实时荧光定量PCR系统 | Life Technologies | -- |
| 罗氏LightCycler仪器 | Roche | -- | |
| FISH | 荧光显微镜 | Nikon | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Sangon | -- |
| RNA质量检测 | Qubit 2.0 RNA试剂盒 | Thermo | -- |
| 反转录 | PrimeScript RT Master Mix试剂盒 | TaKaRa | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Meilunbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| BeyoECL Plus化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| IκBα抗体 | Proteintech | 10268-1-AP | |
| p-IκBα抗体 | Bioss | bs-2513R | |
| p65抗体 | Bioss | bs-0465R | |
| p-p65抗体 | Bioss | bs-0982R | |
| TNF-α抗体 | Bioss | bsm-33207M | |
| MLCK抗体 | Abcam | ab232949 | |
| MLC2抗体 | Cell Signaling Technology | 3672 | |
| P-MLC2抗体 | Cell Signaling Technology | 3672 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Bioss | bs-0465R | |
| 免疫组化 | Claudin-1抗体 | Abcam | -- |
| Occludin抗体 | Booysen | -- | |
| ZO-1抗体 | Booysen | -- | |
| 光学显微镜 | OPTEC | BDS400 | |
| 免疫组化定量 | Image-Pro Plus 6.0软件 | Media Cybernetics | -- |
| 统计分析 | SPSS软件 | SPSS | version |
| GraphPad软件 | GraphPad | version | |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | 1.4.3.67 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TOC制备与感染 | SPF鸡胚日龄（18天），气管环厚度（0.8 mm），预培养时间（48小时），感染剂量（TOC-ID50 10^-4.47/200 μL），感染体积（200 μL/孔），对照组（PBS） 阅读提示：Materials and methods: Preparation of TOCs, Determination of TOC-ID50, Establishment of an in vitro infection model |
| MG载量检测 | DNA提取试剂盒（Omega Bio-Tek），qRT-PCR仪器（7900HT Fast Real-Time PCR System），引物序列（MG16sRF和MG16sRR），扩增循环数（35），退火温度（60°C） 阅读提示：Materials and methods: Mycoplasma load measurement and FISH assay, Table 1 |
| 组织病理学评估 | 固定液（4%甲醛），包埋，切片厚度（约3 μm），H&E染色，评分标准（0-3级） 阅读提示：Materials and methods: Histopathological examination |
| 炎性因子mRNA表达 | RNA提取试剂（Trizol），反转录试剂盒（PrimeScript RT Master Mix），内参基因（β-actin），分析方法（2^-ΔΔCt），引物序列（见表2） 阅读提示：Materials and methods: Total RNA extraction and qRT-PCR, Table 2 |
| 蛋白表达分析 | 蛋白提取（RIPA裂解液），定量（BCA试剂盒），上样量（40 μg），一抗信息，二抗孵育时间（2小时），曝光试剂（BeyoECL Plus） 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis |
| 免疫组化 | 抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液），封闭液（10%正常山羊血清），一抗稀释比例，DAB显色，定量方式（IOD） 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry |