构建伪无菌大鼠模型
消除肠道菌群,研究菌群对肠道运动的影响
使用广谱抗生素(bacitracin、neomycin、streptomycin,各200 mg/kg)连续处理6天,通过16S rRNA测序验证菌群清除效果。
Tongbian decoction restores intestinal microbiota and activates 5-hydroxytryptamine signaling: implication in slow transit constipation.
包含伪无菌大鼠模型、STC大鼠模型、FMT、16S rRNA测序、Western blot、免疫荧光、免疫组化等多层级实验,并进行了功能验证(体重、粪便含水量、碳末推进率)和机制验证(5-HT信号通路)。
SD大鼠伪无菌模型 洛哌丁胺诱导的STC大鼠模型 FMT受体大鼠模型
抗生素处理(bacitracin, neomycin, streptomycin,各200 mg/kg)6天构建伪无菌大鼠 STC模型诱导:洛哌丁胺3 mg/kg/d,持续7天 FMT:供体粪便悬液1 mL/100 g体重灌胃,持续6天 TBD给药剂量:24 g/kg,持续14天(第8-21天) 检测指标:体重、粪便含水量、碳末推进率、5-HT信号通路蛋白表达
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
消除肠道菌群,研究菌群对肠道运动的影响
使用广谱抗生素(bacitracin、neomycin、streptomycin,各200 mg/kg)连续处理6天,通过16S rRNA测序验证菌群清除效果。
建立慢传输型便秘模型并制备不同来源的粪菌悬液
在伪无菌大鼠基础上,使用洛哌丁胺腹腔注射7天诱导STC模型;另外制备对照组、STC组、STC+TBD组供体大鼠粪菌悬液。
明确TBD调节的肠道菌群对STC的治疗作用
通过灌胃将供体粪菌悬液移植至STC受体大鼠,持续6天。
评价各组大鼠便秘表型的改善情况
检测体重、粪便含水量和碳末推进率。
评估结肠组织损伤程度及TBD粪菌移植的改善作用
HE染色观察结肠组织形态学变化并进行组织学评分。
验证粪菌移植对5-HT信号通路的影响
通过免疫组化、免疫荧光和Western blot检测5-HT、TPH1、5-HT4R的表达及EC细胞数量。
分析粪菌移植后肠道菌群结构的变化
收集粪便进行16S rRNA V3-V4区测序,分析菌群多样性和组成。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 麻醉 | 异氟烷 | -- | -- |
| 药物处理 | 盐酸洛哌丁胺 | Xi'anJansen Co., Ltd. | LLJO007 |
| 抗生素处理 | 杆菌肽 | Solarbio | B8181 |
| 新霉素 | Solarbio | N8090 | |
| 链霉素 | Solarbio | S8290 | |
| 免疫组化 | 5-HT一抗 | Sigma | S5545 |
| 二抗 | Servicebio | GB23303 | |
| DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 | Servicebio | G1212 | |
| 免疫荧光 | 红色荧光二抗 | Biyuntian | A0516 |
| 嗜铬粒蛋白A一抗 | Proteintech | 60135 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Biyuntian | A0428 | |
| DAPI | Bioss | C0204002 | |
| Western blot | RIRA裂解液 | Servicebio | G2002 |
| BCA试剂盒 | Servicebio | G2026 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Servicebio | G2037 | |
| TPH1抗体 | CST | 12339S | |
| 5-HT4R抗体 | ABclonal | A2802 | |
| GAPDH抗体 | Servicebio | GB15004 | |
| 二抗 | Servicebio | GB23303 | |
| ECL发光液 | -- | -- | |
| 16S rRNA测序 | DNA提取试剂盒 | TianGen | -- |
| NEB Next® Ultra™ II FS DNA PCR-free文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7430L | |
| Illumina测序平台 | Illumina | -- | |
| 粪便含水量测定 | 电热恒温干燥箱 | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd. | DHC-9030A |
| 碳末推进率测定 | 阿拉伯胶 | Suzhou Yijing Food Additives Co., Ltd. | -- |
| 高岭土 | Tianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd. | -- | |
| 组织学观察 | 光学显微镜DM500 | Leica | DM500 |
| 免疫荧光观察 | 荧光显微镜DMi8 | Leica | DMi8 |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 伪无菌大鼠模型构建 | 抗生素种类及剂量、给药时间、菌群清除效果验证 阅读提示:见2.4节 Materials and methods |
| STC模型构建 | 洛哌丁胺剂量、给药途径、造模周期 阅读提示:见2.4节 Materials and methods |
| 粪菌移植实验 | 供体分组、粪菌悬液制备、移植剂量和频次 阅读提示:见2.3和2.4节 |
| 5-HT信号通路检测 | 抗体来源及稀释比例、组织样本处理 阅读提示:见2.8-2.10节 |
| 肠道菌群分析 | 16S rRNA测序区域、数据分析流程 阅读提示:见2.11节 |