建立吉西他滨耐药细胞系
获得体外模型以研究耐药机制
T24和UMUC3细胞暴露于递增浓度吉西他滨，计算耐药指数。
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基于吉西他滨耐药细胞RNA测序的代谢重编程揭示FASN基因作为膀胱癌的治疗靶点
Metabolic reprogramming based on RNA sequencing of gemcitabine-resistant cells reveals the FASN gene as a therapeutic for bladder cancer.
实验完整度
高文章包含转录组测序、生物信息学建模、细胞功能实验、动物体内实验及临床样本验证等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
T24膀胱癌细胞及其吉西他滨耐药株（T24-R） UMUC3膀胱癌细胞及其吉西他滨耐药株（UMUC3-R） BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
吉西他滨耐药细胞系的建立：通过梯度浓度诱导，RI>5认为成功 FASN敲低慢病毒及shRNA序列 TVB-3166处理浓度：体外1μmol，体内60mg/kg口服每日 吉西他滨处理浓度：体内50mg/kg腹腔注射隔日一次 细胞活力检测：CCK-8试剂盒
摘要
膀胱癌（BLCA）是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤。术后化疗药物灌注和化疗是治疗BLCA的重要手段。然而，一旦发生耐药，BLCA复发后进展迅速。BLCA细胞依赖独特的代谢重写来维持其生长和增殖。然而，BLCA代谢模式改变与耐药之间的关系尚不清楚。目前，这一问题缺乏系统研究。在我们的研究中，我们基于吉西他滨耐药BLCA细胞系的RNA测序和代谢相关基因（MRGs），鉴定并分析了耐药和代谢相关的差异表达基因（RM-DEGs）。然后，我们通过回归分析建立了一个耐药和代谢相关模型（RM-RM）来预测BLCA的总生存期。我们还证实RM-RM与肿瘤代谢、基因突变、肿瘤微环境和药物不良反应显著相关。高耐药和代谢相关风险评分（RM-RS）的患者比低RM-RS的患者表现出更活跃的脂质合成。使用代表性基因脂肪酸合酶（FASN）及其抑制剂（TVB-3166）进行了进一步的体外和体内研究，FASN促进吉西他滨耐药，其抑制剂可逆转这种耐药效应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 膀胱癌吉西他滨耐药与代谢重编程的关系，以及能否通过预测模型和靶向代谢基因改善耐药。
- 核心机制
- FASN通过促进脂质积累导致吉西他滨耐药，抑制FASN可逆转耐药。
- 主要证据
- 体外实验敲低FASN或使用抑制剂TVB-3166后，耐药细胞对吉西他滨敏感性恢复，脂质含量下降；体内实验中敲低FASN或TVB-3166治疗抑制肿瘤生长并逆转耐药。
- 研究意义
- RM-RM模型可辅助预后预测和治疗选择，抑制FASN脂肪酸合成通路成为膀胱癌的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNA测序及差异基因分析
鉴定耐药相关代谢差异基因
对T24-R细胞进行RNA测序，与亲本比较，结合代谢基因筛选RM-DEGs。
构建并验证RM-RM预后模型
评估模型预测BLCA患者总生存期的能力
利用TCGA BLCA队列进行LASSO及多因素Cox回归构建模型，并在独立数据集中验证。
体外功能验证FASN在耐药中的作用
验证FASN表达对耐药性的影响
敲低FASN后检测细胞活力、集落形成和脂质含量。
体内验证FASN敲低和TVB-3166对耐药的作用
验证在体内敲低FASN或使用TVB-3166能否逆转耐药。
皮下移植瘤模型，分组处理，测量肿瘤体积和重量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 吉西他滨 | MCE | HY-17026 |
| TVB-3166 | MCE | -- | |
| 建立耐药细胞系 | 慢病毒（用于FASN敲低） | GeneChem | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 脂质检测 | BODIPY染料 | -- | -- |
| FASN检测 | FASN ELISA试剂盒 | Abcam | ab279412 |
| 脂质检测 | 游离脂肪酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering | -- |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering | -- | |
| 总胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Bis-Tris凝胶 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗GPC2抗体 | Novus | AF2304SP |
| 抗CNOT6L抗体 | Absin | abs108959 | |
| 抗FASN抗体 | Proteintech | 66591-1-Ig | |
| 抗MAP2抗体 | Proteintech | 66846-1-Ig | |
| 抗BMP6抗体 | Bioss | bs-10090R | |
| 抗CARD10抗体 | Bioss | bs-7081R | |
| 抗GALNT12抗体 | Abcam | ab201196 | |
| 抗IgG（小鼠） | Abcam | ab238004 | |
| 抗IgG（山羊） | Beyotime | A7007 | |
| 抗IgG（兔） | Proteintech | 30000-0-AP | |
| 多重免疫荧光 | 抗FASN抗体 | ProteinTech | 66591-1-Ig |
| 抗BMP6抗体 | Bioss | bs-10090R | |
| 抗CXCL12抗体 | ProteinTech | 17402-1-AP | |
| 抗CD34抗体 | Abcam | ab81219 | |
| Western blotting | 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系建立 | 细胞系来源；耐药细胞系诱导条件：浓度梯度0-20μg/ml处理48h，重复直至RI>5 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and reagents 及 Establishment of gemcitabine-resistant cell lines |
| RNA测序 | 重复样本数（3）；差异基因过滤条件（p<0.05，|FC|>2）；测序服务提供商 阅读提示：Materials and methods - RNA sequencing |
| 模型构建 | LASSO和多元Cox回归的具体参数；RM-RS公式；分组依据（中位数） 阅读提示：Materials and methods - Establishment and validation of RM-RM |
| 体外FASN敲低 | shRNA序列；慢病毒滴度或转染效率；FASN敲低效率验证方法；细胞处理：TVB-3166浓度1μmol，吉西他滨浓度5μg/ml（CCK-8），敏感性测试浓度1-32μg/ml处理24h；集落形成接种1000细胞/孔培养1周 阅读提示：Materials and methods - Cell proliferation assays, Drug sensitivity test, Colony formation assay |
| 体内动物实验 | 动物品系、性别和年龄；细胞接种数量（2×10^6）；分组；药物剂量和给药途径（吉西他滨50mg/kg IP QOD，TVB-3166 60mg/kg口服每日）；肿瘤测量频率（每5天）；实验时长（约50天） 阅读提示：Materials and methods - Animal experiments |