SCNT胚胎构建与发育评估
评估恒河猴SCNT胚胎的发育能力，并与ICSI胚胎比较。
使用TSA和Kdm4d处理进行恒河猴SCNT，记录囊胚率、着床率、流产率等，并分析流产时间分布。
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体细胞核移植重编程机制的解析及恒河猴滋养层替换应用
Reprogramming mechanism dissection and trophoblast replacement application in monkey somatic cell nuclear transfer.
实验完整度
高研究包含多组学分析（WGBS、RNA-seq）、体外模型（胚胎、滋养层）、体内模型（猴胚胎移植、胎盘分析）及功能验证（滋养层替换成功克隆）。
主要模型
食蟹猴与恒河猴杂交胚胎（ICSI和SCNT） 恒河猴SCNT胚胎及滋养层 恒河猴SCNT胎盘 SCNT-TR重构胚胎及克隆恒河猴
重点核对
SCNT胚胎：供体细胞为62天胎猴皮肤成纤维细胞，用HVJ-E处理，激活后注入Kdm4d并用TSA处理10小时 胚胎移植：SCNT组转移484个胚胎至96只代孕母猴，SCNT-TR组转移11个重构胚胎至7只代孕母猴 滋养层替换：将SCNT ICM注入去除ICM的ICSI囊胚腔，比例为1:1 DNA甲基化分析：WGBS测序，DMR筛选标准为至少25个CpG位点且甲基化差异≥25% 胎盘钙化分析：使用AR染色和ImageJ定量，CCI和CCN计算有明确公式
摘要
体细胞核移植（SCNT）成功克隆食蟹猴，但因对重编程机制了解有限，其效率仍然较低。值得注意的是，到目前为止尚无恒河猴通过SCNT被克隆。我们的研究对多组学数据集进行比较分析，比较了胞浆内单精子注射（ICSI）胚胎和SCNT胚胎。我们的研究结果揭示，SCNT猴囊胚中DNA甲基化普遍降低，并且母源印记基因的印记丢失。这种印记丢失在体外培养至E17的SCNT胚胎和足月SCNT胎盘中持续存在。此外，SCNT胎盘的组织学检查显示出明显的增生和钙化。为了解决这些缺陷，我们开发了一种滋养层替换方法，最终成功克隆了一只健康的雄性恒河猴。这些发现为猴SCNT的重编程机制提供了有价值的见解，并引入了灵长类克隆的一种有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在解析猴SCNT的重编程机制，并探索提高恒河猴克隆效率的策略。
- 核心机制
- SCNT胚胎中存在从供体细胞继承的DNA甲基化异常，导致母源印记基因印记丢失，如THAP3、DNMT1、SIAH1和RHOBTB3，这可能引起胎盘发育异常和胚胎丢失。
- 主要证据
- 通过WGBS和RNA-seq分析发现SCNT囊胚DNA甲基化水平降低，并鉴定出多个印记基因丢失印记；在SCNT胎盘中也持续丢失DNA甲基化；使用滋养层替换方法成功克隆出健康恒河猴。
- 研究意义
- 研究为理解灵长类SCNT重编程机制提供了见解，并开发了一种改进灵长类克隆效率的滋养层替换策略，可能应用于辅助生殖技术。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多组学分析SCNT胚胎的DNA甲基化和基因表达
比较SCNT和ICSI囊胚的DNA甲基化模式及基因表达差异。
对杂交猴ICSI和SCNT囊胚进行WGBS和RNA-seq，分析甲基化水平、DMRs、印记基因表达等。
印记基因异常分析
鉴定SCNT囊胚中异常表达的印记基因及其与DNA甲基化的关联。
利用人类印记基因数据库，筛选在猴囊胚中表达的候选基因，结合DMRs和表达差异，确认印记丢失的基因。
胚胎植入后阶段印记丢失的验证
验证印记基因的DNA甲基化异常在植入后胚胎和胎盘中持续存在。
对体外培养至E17的胚胎组织（E/A/Y/T）和足月胎盘进行WGBS，分析印记基因甲基化状态。
胎盘形态和钙化分析
评估SCNT胎盘的形态异常和钙化程度。
使用超声检查胎盘增生，使用AR染色检测钙化，计算钙化指数（CCI）和钙化点密度（CCN）。
滋养层替换（TR）方法的建立
开发一种替代SCNT胚胎滋养层的方法，以改善克隆效率。
通过免疫手术分离SCNT ICM，激光辅助去除ICSI胚囊的内细胞团，将SCNT ICM注入ICSIC囊胚腔中，并移植到代孕母猴。
克隆猴的鉴定与嵌合体检测
确认克隆猴的核基因组和线粒体起源，并检测是否存在嵌合体。
通过STR分析验证核基因组与供体细胞一致，通过mtDNA分析确认线粒体来自卵母细胞供体，通过X染色体SNP分析确认胚胎组织来源。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胚胎操作 | HTF培养基 | -- | -- |
| 细胞松弛素B | -- | -- | |
| 核移植 | HVJ-E（仙台病毒包膜） | Cosmo Bio Co.Ltd | 808920 |
| 胚胎激活 | 离子霉素 | -- | -- |
| 6-二甲氨基嘌呤 | -- | -- | |
| 药物处理 | 曲古抑菌素A | Sigma | T1952 |
| 显微注射 | Kdm4d mRNA | -- | -- |
| 胚胎培养 | H9培养基 | -- | -- |
| 滋养层替换 | 酸性台氏液 | Sigma | T1788 |
| 兔抗猴IgG全血清 | Bioss | bs-0335Rs | |
| 豚鼠补体血清 | Fitzgerald | 32R-CP004 | |
| 胚胎培养 | 胚胎干细胞级胎牛血清 | -- | -- |
| 细胞培养 | 胶原酶IV | -- | -- |
| DNA酶 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 免疫染色 | 抗α-微管蛋白抗体 | abcam | ab80779 |
| 抗磷酸化组蛋白H3抗体 | abcam | ab5176 | |
| Alexa Fluor 488标记亲和纯驴抗小鼠IgG (H+L) | JackSon ImmunoResearch | 715-545-150 | |
| Alexa Fluor Cy3标记亲和纯驴抗兔IgG | JackSon ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 四倍体胚胎制作 | D-甘露醇 | Sigma | M4125 |
| 电融合 | Eppendorf Multiporator 4308电穿孔系统 | Eppendorf | -- |
| 电融合胚胎观察 | H2B-EGFP mRNA | Addgene | 53744 |
| 核型分析 | 秋水仙素 | APExBio | A3324 |
| 吉姆萨染色液 | Sigma | GS500 | |
| VS120显微镜 | Olympus | -- | |
| 胎盘钙化分析 | 茜素红染色试剂盒 | Servicebio | G1038 |
| DNA提取 | 基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen | DP304-03 |
| PCR产物纯化 | Monarch PCR & DNA纯化试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| RNA体外转录 | mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒 | Life Technologies | AM1345 |
| RNA纯化 | MEGAclear试剂盒 | Life Technologies | AM1908 |
| RNA体外转录 | mMESSAGE mMACHINE SP6转录试剂盒 | Life Technologies | AM1340 |
| RNA测序文库构建 | SMART-Seq v4超低投入RNA试剂盒 | Clontech | 634888 |
| TruePrep DNA文库制备试剂盒V2 | Vazyme | TD503 | |
| 文库定量 | Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Thermo Scientific | Q32854 |
| 文库质控 | Fragment Analyzer仪器 | Agilent | -- |
| 测序 | Novaseq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| WGBS文库构建 | EZ DNA甲基化直接试剂盒 | Zymo Research | D5020 |
| Lambda DNA | Promega | D152A | |
| Klenow聚合酶 | Enzymatics | P7010-HC-L | |
| SPRI磁珠 | -- | -- | |
| WGBS文库构建（卵母细胞） | PureLink PCR微量试剂盒 | Invitrogen | K310050 |
| Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | -- | |
| Agencourt RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| ABI StepOnePlus实时PCR系统 | Life Technologies | -- | |
| WGBS文库构建（胎盘） | MiniElute PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Methylation-Gold试剂盒 | ZYMO | -- | |
| STB细胞分离 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| Percoll分离液 | -- | -- | |
| STR分析 | ABI PRISM 3730遗传分析仪 | Applied Biosystems | -- |
| 胚胎成像 | FV3000共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| FV10i共聚焦成像系统 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SCNT胚胎构建 | 供体细胞类型（胎儿皮肤成纤维细胞）、HVJ-E处理、激活方法（ionomycin和6-DMAP）、Kdm4d mRNA注射、TSA处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Monkey SCNT and ICSI |
| 胚胎移植 | 移植胚胎数量、代孕母猴选择标准、移植时间（胚胎发育阶段）、手术方式 阅读提示：Methods: Monkey embryo culture and transfer |
| 滋养层替换 | ICSI囊胚处理（激光打孔）、SCNT-ICM获取方法（免疫手术）、注入比例（1:1）、操作时间窗口 阅读提示：Methods: Trophoblast replacement |
| 多组学分析 | 样本类型（杂交胚胎）、测序平台、比对基因组（macFas5）、DMR筛选标准（至少25个CpG，甲基化差异≥25%） 阅读提示：Methods: WGS data processing, RNA-seq library construction, WGBS data analysis |
| 胎盘形态分析 | 胎盘取材时间、AR染色步骤、钙化定量参数（CCI, CCN）、图像分析软件设置 阅读提示：Methods: Alizarin red staining, Morphometry of placenta calcification |
| 嵌合体检测 | SNP位点选择、深度测序深度（最少10000读长）、样本类型（皮肤、耳、外周血） 阅读提示：Methods: Chimerism examination of the cloned rhesus monkey |