构建基于干性相关基因的预后模型
识别与子宫内膜癌预后相关的干性基因。
基于TCGA队列，使用EdgeR筛选差异表达基因，与干性基因取交集，然后通过单因素、LASSO和多因素Cox回归构建十基因预后模型。
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LGR5，一个预后的干细胞靶点，通过自噬激活促进子宫内膜癌增殖。
LGR5, a prognostic stem cell target, promotes endometrial cancer proliferation through autophagy activation.
实验完整度
高包含多种验证层级：TCGA和PKUPH队列的预后模型构建及验证、单细胞测序分析、免疫组化分析、以及体外细胞实验（敲低和过表达LGR5后检测增殖和自噬标志物）。
主要模型
Ishikawa细胞系 AN3CA细胞系 HEC-50B细胞系 TCGA队列 PKUPH队列
重点核对
LGR5在Ishikawa细胞中高表达，在AN3CA和HEC-50B中低表达 使用sh-LGR5敲低Ishikawa细胞，OE-LGR5过表达AN3CA细胞 CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖 自噬标志物LC3B、ATG5和p62的表达水平
摘要
子宫内膜癌（EC）是全球女性常见的恶性肿瘤。虽然早期EC预后良好，但晚期子宫内膜癌仍存在耐药和复发风险。癌症干细胞（CSCs）与耐药和复发密切相关，目前研究较少。在此，我们构建了一个包含十个干性相关预后基因的风险模型。与低风险组患者相比，高风险组患者的总生存时间较短。该模型的准确性通过TCGA（AUC = 0.779）和北京大学人民医院（PKUPH，AUC = 0.864）队列的ROC验证。多因素回归分析中，风险评分和分期是独立危险因素，随后用于构建列线图并在TCGA队列中验证。LGR5与总生存期显著相关，并参与Wnt信号通路。此外，在TCGA数据库中，LGR5在EC组织中高表达，并与年龄、分期、组织学类型和绝经状态相关。LGR5的过表达加速了EC细胞的增殖速率，这可能与自噬激活有关。总之，我们的研究基于TCGA数据库的转录测序数据建立了预后模型，并在PKUPH队列中进行了验证，对EC的预后评估具有前瞻性临床意义。我们系统地研究了EC中的编码基因LGR5，这可能有助于临床医生对EC进行个性化预后评估和有效的临床决策。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LGR5在子宫内膜癌中的表达情况及其对预后和细胞增殖的影响及潜在机制。
- 核心机制
- LGR5通过激活自噬促进子宫内膜癌细胞的增殖。
- 主要证据
- 在TCGA和PKUPH队列中，LGR5高表达与较短的总生存期相关；在体外过表达LGR5促进细胞增殖并增加自噬标志物LC3B-II、ATG5和p62的表达。
- 研究意义
- LGR5可能作为子宫内膜癌的预后标志物和治疗靶点，为个性化预后评估和临床决策提供帮助。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预后模型的内部和外部验证
验证预后模型的准确性和适用性。
在TCGA和PKUPH队列中，根据中位风险评分将患者分为高风险和低风险组，分析风险评分分布和生存状态，绘制Kaplan-Meier曲线和ROC曲线。
构建和评估列线图
提供预测EC患者总生存期的工具。
使用单因素和多因素Cox回归确定独立风险因素，并构建列线图，绘制校准曲线。
筛选核心基因
确定预后模型中影响最大的基因。
比较正常和肿瘤样本中十个基因的表达，进行Kaplan-Meier生存分析，并进行GO和KEGG富集分析，以及单细胞RNA测序分析。
LGR5表达与临床病理特征的关系
评估LGR5表达与EC患者临床特征的相关性。
在GSE17025和TCGA中验证LGR5表达，分析其与年龄、分期、组织学类型、绝经状态等的关系，并通过免疫组化验证蛋白表达，并检测MPA对LGR5表达的影响。
验证LGR5对细胞干性的影响
检测LGR5是否影响EC细胞的干性特征。
在Ishikawa中敲低LGR5，在AN3CA中过表达LGR5，通过球体形成实验评估干性，并通过Western blot检测干性标志物NANOG和SOX2的表达。
验证LGR5对细胞增殖的影响
检测LGR5对EC细胞增殖能力的影响。
通过CCK8和克隆形成实验检测敲低或过表达LGR5后细胞增殖的变化。
验证LGR5对自噬的影响
揭示LGR5促进增殖的可能机制。
通过GSEA分析LGR5高和低表达组中富集的通路，并通过免疫荧光和Western blot检测自噬标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| LGR5短发夹RNA | Shanghai Genechem Co., Ltd. | -- | |
| LGR5过表达质粒 | Shanghai Genechem Co., Ltd. | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA法 | -- | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | -- | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Nano500分光光度计 | ALLSHENG | -- | |
| 球体形成实验 | 表皮生长因子 | -- | -- |
| B27补充因子 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| CCK8实验 | CCK8溶液 | -- | -- |
| Tecan infinite M200多功能酶标仪 | Tecan | -- | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 抗LC3B抗体 | -- | ab192890 |
| 山羊抗大鼠Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21094 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 高内涵成像系统 | Operetta CLS | -- | |
| 免疫组化 | 抗LGR5抗体 | Bioss | bs-20747R |
| SP-9000免疫组化试剂盒 | ZSGB-BIO | -- | |
| 药物处理 | 醋酸甲羟孕酮 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 预后模型构建 | TCGA队列的样本数量（552个EC样本和35个正常样本） 阅读提示：Material and methods, Data source |
| 预后模型验证 | PKUPH队列的样本数量（24个） 阅读提示：Material and methods, Data source |
| 细胞培养 | Ishikawa细胞培养于DMEM/F12（含10%FBS），AN3CA和HEC-50B培养于MEM 阅读提示：Material and methods, Cell culture and transfection |
| LGR5敲低/过表达 | 慢病毒载体构建的时长和效率（文中未明确说明） 阅读提示：Material and methods, Cell culture and transfection |
| MPA处理 | MPA浓度（0, 30, 60 µM）和处理时间（文中未明确说明） 阅读提示：Results, Verification of the Relationship between LGR5 and Clinicopathological Factors |