药物库筛选
从已批准药物库中筛选能诱导MSCs软骨形成和骨形成的小分子化合物。
使用2040种小分子药物处理HUC-MSCs，通过TB染色和COL2A1蛋白表达检测，筛选出包括NAT在内的8个候选药物。
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发现牛磺胆酸钠水合物作为一种通过靶向MAPK3治疗椎间盘退变的新型再利用药物
Discovery of Taurocholic Acid Sodium Hydrate as a Novel Repurposing Drug for Intervertebral Disc Degeneration by Targeting MAPK3.
实验完整度
高包含药物库筛选、体外细胞实验、小鼠IDD模型、转录组分析、SPR-LC-MS靶点鉴定及体外/体内功能验证。
主要模型
人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs） C57BL/6小鼠IDD模型
重点核对
HUC-MSCs第6至12代培养，NAT浓度1 μM 小鼠分组：NC、IDD_dH2O、IDD_NAT1（2 mg/kg）、IDD_NAT2（20 mg/kg），每组6只，每周两次灌胃，持续8周 尾椎间盘穿刺损伤模型：26G针头，刺入深度1.5 mm，停留30秒，旋转拔出 U0126（10 μM）处理HUC-MSCs 0.5小时和1小时，共14天 SPR-LC-MS检测NAT靶蛋白，NAT浓度100 mM
摘要
目的：目前，超过50岁的人群中超过90%患有椎间盘退变（IDD），但目前尚无理想的药物。本研究旨在为IDD寻找一种新药。方法：本研究使用了包含2040种小分子化合物的已批准小分子药物库。我们发现牛磺胆酸钠水合物（NAT）能够诱导间充质干细胞（MSCs）的软骨形成和骨形成。随后，建立了IDD小鼠模型，并进行了尾椎间盘转录组分析、表面等离子体共振分析（SPR）结合液相色谱-串联质谱分析（LC-MS），以研究NAT对IDD的治疗效果和靶蛋白。使用Micro-CT评估松质骨。检测了成骨（OCN、RUNX2）、软骨形成（COL2A1、SOX9）以及靶点相关（ERK1/2、p-ERK1/2）蛋白的表达。进行碱性磷酸酶染色以评估成骨分化。分析血常规和血生化指标以评估NAT的安全性。结果：结果表明NAT能够诱导MSCs的软骨形成和骨形成。进一步实验证实NAT能够改善小鼠的继发性骨质疏松并延缓IDD的发展。转录组分析鉴定出128个NAT的常见基因和8条京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路。SPR-LC-MS分析检测到NAT的57个靶蛋白，包括MAPK3（丝裂原活化蛋白激酶3），也称为ERK1（细胞外调节蛋白激酶1）。进一步验证实验证实NAT显著降低了ERK1/2的磷酸化表达。结论：NAT通过靶向MAPK3诱导MSCs的软骨形成和骨形成，改善继发性骨质疏松并延缓小鼠IDD的进展。此外，MAPK3，尤其是MAPK3的磷酸化，可能成为IDD治疗的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找一种能够治疗椎间盘退变（IDD）的再利用药物，并阐明其作用机制和靶点。
- 核心机制
- NAT通过靶向MAPK3，抑制ERK1/2的磷酸化，从而诱导MSCs的软骨形成和骨形成，改善继发性骨质疏松并延缓IDD进展。
- 主要证据
- 体外实验显示NAT上调COL2A1和OCN表达，降低p-ERK1/2水平；体内小鼠模型证实NAT改善骨质疏松和IDD，mIHC显示NAT减轻IDD引起的ERK1/2升高和COL2A1、OCN降低。
- 研究意义
- MAPK3，尤其是其磷酸化，可能成为IDD治疗的潜在治疗靶点；NAT作为一种再利用药物，为IDD治疗提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证NAT对MSCs的作用
验证NAT对HUC-MSCs软骨形成和骨形成的影响。
检测TB染色、COL2A1蛋白和mRNA表达、OCN和PPARγ mRNA表达。
建立IDD小鼠模型及NAT治疗
评估NAT对IDD小鼠的治疗效果。
通过针刺尾椎间盘建立IDD模型，给予不同剂量NAT灌胃8周，然后进行micro-CT、组织学、IHC、ALP染色和血液分析。
转录组分析
鉴定NAT处理后的差异表达基因和通路。
对Co6/7椎间盘进行RNA测序，分析差异基因和KEGG通路。
靶蛋白鉴定
鉴定NAT在HUC-MSCs中的直接靶蛋白。
使用SPR-LC-MS分析，鉴定出57个靶蛋白，包括MAPK3。
靶点验证
验证MAPK3是否为NAT的靶点。
使用ERK1/2抑制剂U0126干预HUC-MSCs，检测COL2A1、SOX9、OCN、RUNX2、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表达；体内使用mIHC检测Co4/5椎间盘。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物库筛选 | 牛磺胆酸钠水合物 | 上海陶素生化科技有限公司 | 345909-26-4 |
| 细胞培养 | 胰岛素-转铁蛋白-硒 | 碧云天 | -- |
| 二甲基亚砜 | Sigma | -- | |
| 细胞染色 | 甲苯胺蓝 | 索莱宝 | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | 索莱宝 | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 无蛋白快速封闭液 | Epizyme | PS108P | |
| COL2A1抗体 | Abcam | -- | |
| OCN抗体 | Santa | -- | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | -- | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling | -- | |
| p-ERK1/2抗体 | Cell Signaling | -- | |
| SOX9抗体 | Affinity | -- | |
| RUNX2抗体 | Abcam | -- | |
| eBlot Touch imager S成像系统 | eBlot | -- | |
| RT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Evo M-MLVRT预混液 | Accurate Biotechnology | AG11706 | |
| Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11701 | |
| IHC/mIHC | 过氧化氢 | Boster | -- |
| 山羊血清 | Boster | -- | |
| IHC | 兔SP试剂 | ZSGB-Bio | 18112A11 |
| COL2A1抗体（IHC） | Bioss | -- | |
| OCN抗体（IHC） | Affinity | -- | |
| mIHC | 四色多重荧光免疫组化染色试剂盒 | Absin | -- |
| 含DAPI封片剂 | abcam | ab104139 | |
| ECLIPSE Ti2-E成像系统 | Nikon | -- | |
| 血液分析 | Mindray BC-2600Vet全自动血液分析仪 | Mindray | -- |
| IDEXX Catalyst Dx生化分析仪 | IDEXX | -- | |
| ALP染色 | ALP染色试剂盒 | Beyotime | -- |
| Micro-CT | 微型CT系统（μCT 80） | Scanc Medical | -- |
| 3D建模 | Mimics 20.0软件 | -- | -- |
| 转录组测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| SPR-LC-MS | bScreen LB 991无标记微阵列系统 | Berthold Technologies | -- |
| BioDot AD-1520阵列打印机 | BIODOT Inc. | -- | |
| 靶点验证 | U0126 | Cell Signaling | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 药物库筛选 | HUC-MSCs培养条件、药物浓度、培养时间 阅读提示：Methods部分“Screening of the Approved Small Molecular Drug Library” |
| 细胞培养 | HUC-MSCs的代次、培养基、细胞密度 阅读提示：Methods部分“Culturation and Characteristic of HUC-MSCs” |
| IDD模型建立 | 小鼠品系、年龄、性别、麻醉方法、穿刺针规格、穿刺深度、停留时间、旋转拔出 阅读提示：Methods部分“Induction of IDD Model and NAT Intragastric Administration” |
| 药物处理 | NAT剂量（2 mg/kg和20 mg/kg）、灌胃体积（220 μL）、频率（每周两次）、持续时间（8周） 阅读提示：Methods部分“Induction of IDD Model and NAT Intragastric Administration” |
| 蛋白质检测 | 抗体稀释比例、孵育时间、内参选择 阅读提示：Methods部分“Western Blot” |
| 靶点验证 | U0126浓度（10 μM）、处理时间（0.5小时和1小时）、总干预时间（14天） 阅读提示：Methods部分“Inhibition of MAPK3 Expression in HUC-MSCs” |