富含血小板的纯血浆促进Semaphorin-3A表达:改善体外椎间盘退变的新见解

Pure platelet-rich plasma promotes semaphorin-3A expression: a novel insight to ameliorate intervertebral disk degeneration in vitro.

作者信息Jie Huang, Shi-Lin Lian, Jia-Heng Han, Zheng-Cao Lu, Yu Ding
PMID37864189
发布时间2023-10
DOI10.1186/s13018-023-04290-7

实验完整度

高

该研究包含体外细胞实验(NPCs培养、IL-1β诱导)和离体器官培养(IVD组织),并通过EDU、TUNEL、Western blot、RT-qPCR、ELISA、免疫荧光、免疫组化等技术进行功能验证和机制验证。

主要模型

大鼠原代髓核细胞(NPCs) 大鼠椎间盘器官培养模型 IL-1β诱导的椎间盘退变体外模型

重点核对

P-PRP与L-PRP的制备方法(两次离心,离心转速和时间) IL-1β诱导浓度(10 ng/ml)及处理时间 PRP处理剂量(20 μL注射入IVD) 关键检测指标(Sema3A、CD31、NF200、p65/p-p65) 统计方法(t检验、单因素方差分析,p<0.05)

摘要

富含血小板的血浆(PRP)可有效治疗椎间盘退变(IVDD)。虽然确切过程已被完全理解,但据信使用不含白细胞的纯PRP(P-PRP)是预防IVDD的更好选择。Semaphorin-3A(Sema3A)是血管生成和神经支配的抑制剂,对于维持IVDD的稳态至关重要。PRP是否通过调节Sema3A来预防IVDD,尚未得到充分研究。本研究旨在阐明P-PRP在体外IVDD发展过程中如何影响Sema3A。方法:将从8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠分离的髓核细胞(NPCs)暴露于10 ng/ml IL-1β,然后在体外用P-PRP或白细胞血小板血浆(L-PRP)处理,随后通过免疫染色、定量实时聚合酶链反应(qPCR)、蛋白质印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)测量细胞增殖、凋亡和微观结构、炎症基因和Sema3A表达以及合成代谢和分解代谢蛋白表达。结果:与L-PRP相比,P-PRP具有更高浓度的生长因子,但更低浓度的炎症物质。P-PRP增加了NPCs的增殖,而IL-1β的干预减轻了细胞凋亡。合成代谢基因、聚集蛋白聚糖和II型胶原蛋白表达水平较高。MMP-3和ADAMTS-4两种分解代谢或炎症基因表达水平较低。P-PRP注射后Sema3A活性增强,而CD31和NF200表达水平被抑制。结论:P-PRP通过调节NF-κB信号通路促进Sema3A表达,从而增强IVDD中NPCs的功能,这可能为IVDD提供新的治疗选择。本文的转化潜力:这些发现为治疗IVDD提供了新的治疗靶点,并为PRP的可能机制和Sema3A在IVDD进展中的作用提供了新见解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
P-PRP是否通过调节Sema3A表达来改善IL-1β诱导的椎间盘退变,并探讨其潜在机制?
核心机制
P-PRP通过抑制NF-κB信号通路,促进Sema3A表达,从而减轻炎症和ECM降解,抑制血管生成和神经支配,减缓IVDD进展。
主要证据
在IL-1β诱导的NPCs和IVD器官模型中,P-PRP显著增加细胞增殖、合成代谢基因(聚集蛋白聚糖、胶原II)表达,降低分解代谢基因(MMP-3、ADAMTS-4)表达,并提高Sema3A表达,同时降低CD31和NF200表达;Western blot和免疫荧光显示p65和p-p65表达降低。
研究意义
该研究为IVDD治疗提供了新的靶点(Sema3A),并揭示了PRP(特别是P-PRP)的潜在机制,可能为IVDD的预防和治疗提供新策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

PRP的制备与成分分析

制备P-PRP和L-PRP并比较其成分差异,为后续实验提供处理物。

采用两步离心法从大鼠全血制备P-PRP和L-PRP;使用自动血液分析仪计数血小板和白细胞;ELISA检测TNF-α、IL-1β、TGF-β、PDGF和VEGF浓度。

2

NPCs的分离、培养与IL-1β诱导

建立IL-1β诱导的椎间盘退变细胞模型,用于评估PRP的效果。

从8周龄雄性SD大鼠椎间盘分离髓核组织,经0.2% II型胶原酶消化获得NPCs,培养于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基;随后用10 ng/ml IL-1β处理诱导退变。

3

细胞增殖和凋亡检测

评估P-PRP和L-PRP对IL-1β诱导的NPCs增殖和凋亡的影响。

通过EDU实验检测细胞增殖,TUNEL实验检测细胞凋亡。

4

ECM代谢相关基因和蛋白表达检测

验证PRP对ECM合成和分解代谢平衡的影响。

通过RT-qPCR检测聚集蛋白聚糖、胶原II、MMP-3、ADAMTS-4的mRNA表达;Western blot检测相关蛋白表达;免疫荧光染色观察蛋白分布。

5

Sema3A活性及血管/神经标志物检测

检测PRP对Sema3A表达及血管生成和神经支配相关标志物的影响。

通过RT-qPCR和Western blot检测Sema3A、CD31、NF200的mRNA和蛋白表达;免疫组化染色检测IVD组织中CD31和NF200表达。

6

NF-κB信号通路激活检测

探讨PRP对IL-1β诱导的NF-κB信号通路活化的影响。

通过RT-qPCR检测p65的mRNA表达;Western blot检测p65和p-p65蛋白水平;免疫荧光染色观察p65核转位及p-p65表达。

7

离体器官培养验证

在组织水平验证PRP对IVDD的保护作用。

分离大鼠尾椎椎体-椎间盘-椎体单元,用IL-1β诱导退变,注射P-PRP或L-PRP,在7、10、14天后进行HE和免疫组化染色观察形态学变化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
肝素钠抗凝管----
TNF-α ELISA试剂盒ygyr biotechMM0180R2
IL-1β ELISA试剂盒mibioml003057-2
TGF-β ELISA试剂盒mibioml002856-2
PDGF ELISA试剂盒mibioml00314-2
VEGF ELISA试剂盒mibioml002862-2
II型胶原酶meilunbioMB2665
DMEM/F12培养基Gibco--
RIPA裂解液----
BCA蛋白定量试剂盒MDLMD913053
SDS-PAGE凝胶Bio-Rad--
PVDF膜Millipore--
TBST缓冲液Beyotime--
II型胶原蛋白抗体AffinityAF0135
聚集蛋白聚糖抗体AffinityDF7561
MMP-3抗体ZEN BIO340612
ADAMTS-4抗体Biossbs-4191R
p65抗体ZEN BIOR25150
p-p65抗体ZEN BIO310013
CD31抗体Proteintech28083-1-AP
NF200抗体Proteintech18934-1-AP
Sema3A抗体AffinityDF8609
β-actin抗体AffinityAF7018
HRP标记的山羊抗兔IgGZEN BIO511103
ECL化学发光试剂UVPGelDoc-It310
化学发光成像系统Bio-Rad170-8280
TRIzol试剂----
SYBR Green荧光染料----
锇酸----
Epon-Araldite树脂----
柠檬酸铅----
醋酸铀----
透射电子显微镜HitachiHT7800
SPSS软件IBM Corp.22.0
GraphPad Prism软件GraphPad Software Inc.9.0
DAPI染色液----
抗荧光淬灭剂----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
PRP制备
P-PRP和L-PRP的制备方法(两步离心法,具体转速和时间)、活化条件(凝血酶和氯化钙浓度及活化时间)
阅读提示:Materials and methods - Preparation of pure platelet-rich plasma and leukocyte platelet-rich plasma
细胞培养与诱导
NPCs的分离方法(胶原酶浓度、消化时间)、培养条件(培养基、血清浓度)、IL-1β诱导浓度(10 ng/ml)和处理时间
阅读提示:Materials and methods - NPCs isolation and culture
细胞功能检测
EDU和TUNEL实验的具体步骤(孵育时间、试剂盒货号)
阅读提示:Materials and methods - EDU assay, TUNEL assay
分子表达检测
RT-qPCR引物序列、Western blot抗体稀释比例和来源、免疫荧光染色条件
阅读提示:Materials and methods - Western blot analysis, Quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction, Immunofluorescence staining; Table 1
离体验证
椎间盘器官培养模型的制备、IL-1β处理、PRP注射剂量和观察时间点
阅读提示:Materials and methods - PRP injection into IVDs and organ culture